Kombination von Terpenverbindungen auf Basis ätherischer Pflanzenöle als larvizides und adultes Mittel gegen Aedes aegypti (Diptera: Culicidae)

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Kombinationen pflanzlicher Insektizide können synergistische oder antagonistische Wechselwirkungen gegen Schädlinge zeigen. Angesichts der rasanten Ausbreitung von durch Aedes-Mücken übertragenen Krankheiten und der zunehmenden Resistenz von Aedes-Mückenpopulationen gegenüber herkömmlichen Insektiziden wurden 28 Kombinationen von Terpenverbindungen auf Basis ätherischer Pflanzenöle formuliert und gegen Larven und adulte Aedes aegypti getestet. Fünf ätherische Pflanzenöle wurden zunächst hinsichtlich ihrer larviziden und adulten Wirksamkeit untersucht. Mittels GC-MS-Analyse wurden in jedem Öl zwei Hauptbestandteile identifiziert. Die identifizierten Hauptbestandteile – Diallyldisulfid, Diallyltrisulfid, Carvon, Limonen, Eugenol, Methyleugenol, Eucalyptol, Eudesmol und Mücken-α-Pinen – wurden käuflich erworben. Anschließend wurden binäre Kombinationen dieser Verbindungen in subletalen Dosen hergestellt und deren synergistische und antagonistische Wirkung getestet. Die besten larviziden Zusammensetzungen werden durch Mischen von Limonen mit Diallyldisulfid erzielt, die besten adultiziden Zusammensetzungen durch Mischen von Carvon mit Limonen. Das kommerziell erhältliche synthetische Larvizid Temephos und das Adultizid Malathion wurden einzeln und in binären Kombinationen mit Terpenoiden getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass die Kombination von Temephos und Diallyldisulfid sowie von Malathion und Eudesmol die wirksamste war. Diese potenten Kombinationen bergen Potenzial für den Einsatz gegen Aedes aegypti.
Ätherische Pflanzenöle sind sekundäre Pflanzenstoffe, die verschiedene bioaktive Verbindungen enthalten und als Alternative zu synthetischen Pestiziden zunehmend an Bedeutung gewinnen. Sie sind nicht nur umwelt- und anwenderfreundlich, sondern stellen auch ein Gemisch verschiedener bioaktiver Verbindungen dar, wodurch die Wahrscheinlichkeit der Resistenzentwicklung verringert wird¹. Mithilfe der GC-MS-Technologie untersuchten Forscher die Bestandteile verschiedener ätherischer Pflanzenöle und identifizierten über 3.000 Verbindungen aus 17.500 aromatischen Pflanzen². Die meisten dieser Verbindungen wurden auf insektizide Eigenschaften getestet und zeigten insektizide Wirkung^3,4. Einige Studien heben hervor, dass die Toxizität der Hauptkomponente der Verbindung der von rohem Ethylenoxid entspricht oder diese sogar übersteigt. Die Verwendung einzelner Verbindungen kann jedoch, wie bei chemischen Insektiziden, erneut die Entwicklung von Resistenzen begünstigen^5,6. Daher liegt der aktuelle Fokus auf der Herstellung von Gemischen auf Ethylenoxidbasis, um die insektizide Wirksamkeit zu verbessern und die Wahrscheinlichkeit von Resistenzen in den Zielschädlingspopulationen zu verringern. Einzelne Wirkstoffe in ätherischen Ölen können in Kombination synergistische oder antagonistische Effekte zeigen, die die Gesamtwirkung des ätherischen Öls widerspiegeln. Dies wurde in früheren Studien ausführlich belegt^7,8. Auch ätherische Öle und ihre Bestandteile werden zur Vektorkontrolle eingesetzt. Die mückentötende Wirkung ätherischer Öle wurde umfassend an Culex- und Anopheles-Mücken untersucht. Mehrere Studien haben versucht, durch die Kombination verschiedener Pflanzen mit kommerziell erhältlichen synthetischen Pestiziden wirksame Pestizide zu entwickeln, um die Gesamttoxizität zu erhöhen und Nebenwirkungen zu minimieren⁹. Studien zu solchen Verbindungen gegen Aedes aegypti sind jedoch selten. Fortschritte in der Medizin und die Entwicklung von Medikamenten und Impfstoffen haben zur Bekämpfung einiger durch Vektoren übertragener Krankheiten beigetragen. Das Vorkommen verschiedener Serotypen des von der Aedes-aegypti-Mücke übertragenen Virus hat jedoch zum Scheitern von Impfprogrammen geführt. Daher sind Vektorkontrollprogramme im Falle solcher Krankheiten die einzige Möglichkeit, die Ausbreitung der Krankheit zu verhindern. In der aktuellen Situation ist die Bekämpfung von Aedes aegypti von großer Bedeutung, da diese Mücke ein wichtiger Überträger verschiedener Viren und ihrer Serotypen ist, die Denguefieber, Zika, hämorrhagisches Denguefieber, Gelbfieber usw. verursachen. Besonders besorgniserregend ist, dass die Fallzahlen fast aller durch Aedes-Mücken übertragenen Krankheiten in Ägypten und weltweit jährlich steigen. Daher besteht ein dringender Bedarf an umweltfreundlichen und wirksamen Bekämpfungsmaßnahmen gegen Aedes aegypti. Ätherische Öle, ihre Bestandteile und Kombinationen bieten hierfür vielversprechende Ansätze. Ziel dieser Studie war es daher, wirksame synergistische Kombinationen wichtiger ätherischer Pflanzenbestandteile aus fünf Pflanzen mit insektiziden Eigenschaften (Minze, Heiliges Basilikum, Gefleckter Eukalyptus, Schwefellauch und Teebaum) gegen Aedes aegypti zu identifizieren.
Alle ausgewählten ätherischen Öle zeigten eine potenzielle larvizide Wirkung gegen Aedes aegypti mit LC50-Werten nach 24 Stunden von 0,42 bis 163,65 ppm. Die höchste larvizide Wirkung wurde für Pfefferminzöl (Mp) mit einem LC50-Wert von 0,42 ppm nach 24 Stunden festgestellt, gefolgt von Knoblauchöl (As) mit einem LC50-Wert von 16,19 ppm nach 24 Stunden (Tabelle 1).
Mit Ausnahme von Ocimum Sainttum (Os EO) zeigten alle anderen vier untersuchten ätherischen Öle deutliche allergene Wirkungen mit LC50-Werten zwischen 23,37 und 120,16 ppm nach 24 Stunden Exposition. Thymophilus striata (Cl) EO war mit einem LC50-Wert von 23,37 ppm innerhalb von 24 Stunden am wirksamsten bei adulten Insekten, gefolgt von Eucalyptus maculata (Em) mit einem LC50-Wert von 101,91 ppm (Tabelle 1). Der LC50-Wert für Os konnte hingegen noch nicht bestimmt werden, da die höchste Mortalitätsrate von 53 % bei der höchsten Dosis beobachtet wurde (Ergänzende Abbildung 3).
Die beiden Hauptbestandteile jedes ätherischen Öls wurden anhand der Ergebnisse der NIST-Bibliotheksdatenbank, der prozentualen Flächenanteile im GC-Chromatogramm und der MS-Spektren identifiziert und ausgewählt (Tabelle 2). Für ätherisches Öl As wurden Diallyldisulfid und Diallyltrisulfid als Hauptbestandteile identifiziert; für ätherisches Öl Mp waren es Carvon und Limonen; für ätherisches Öl Em waren es Eudesmol und Eucalyptol; für ätherisches Öl Os waren es Eugenol und Methyleugenol; und für ätherisches Öl Cl waren es Eugenol und α-Pinen (Abbildung 1, Ergänzende Abbildungen 5–8, Ergänzende Tabellen 1–5).
Ergebnisse der Massenspektrometrie der wichtigsten Terpenoide ausgewählter ätherischer Öle (A-Diallyldisulfid; B-Diallyltrisulfid; C-Eugenol; D-Methyleugenol; E-Limonen; F-aromatisches Ceperon; G-α-Pinen; H-Cineol; R-Eudamol).
Insgesamt wurden neun Verbindungen (Diallyldisulfid, Diallyltrisulfid, Eugenol, Methyleugenol, Carvon, Limonen, Eucalyptol, Eudesmol, α-Pinen) als wirksame Hauptbestandteile ätherischer Öle identifiziert und einzeln auf ihre Wirksamkeit gegen Aedes aegypti im Larvenstadium getestet. Eudesmol zeigte die höchste larvizide Aktivität mit einem LC50-Wert von 2,25 ppm nach 24 Stunden Exposition. Auch Diallyldisulfid und Diallyltrisulfid wiesen potenziell larvizide Wirkung auf, mit mittleren subletalen Dosen im Bereich von 10–20 ppm. Eine moderate larvizide Aktivität wurde auch für Eugenol, Limonen und Eucalyptol mit LC50-Werten von 63,35 ppm bzw. 139,29 ppm beobachtet. und 181,33 ppm nach 24 Stunden (Tabelle 3). Methyleugenol und Carvon zeigten jedoch selbst bei den höchsten Dosen keine signifikante larvizide Wirkung, weshalb keine LC50-Werte berechnet wurden (Tabelle 3). Das synthetische Larvizid Temephos wies nach 24 Stunden Exposition eine mittlere letale Konzentration von 0,43 ppm gegenüber Aedes aegypti auf (Tabelle 3, Ergänzungstabelle 6).
Sieben Verbindungen (Diallyldisulfid, Diallyltrisulfid, Eucalyptol, α-Pinen, Eudesmol, Limonen und Carvon) wurden als Hauptbestandteile wirksamer ätherischer Öle identifiziert und einzeln an adulten ägyptischen Aedes-Mücken getestet. Laut Probit-Regressionsanalyse zeigte Eudesmol mit einem LC50-Wert von 1,82 ppm das höchste Potenzial, gefolgt von Eucalyptol mit einem LC50-Wert von 17,60 ppm nach 24-stündiger Exposition. Die übrigen fünf getesteten Verbindungen wirkten mäßig schädlich auf adulte Mücken mit LC50-Werten zwischen 140,79 und 737,01 ppm (Tabelle 3). Das synthetische Organophosphor-Malathion war weniger wirksam als Eudesmol, aber wirksamer als die anderen sechs Verbindungen, mit einem LC50-Wert von 5,44 ppm über den 24-stündigen Expositionszeitraum (Tabelle 3, Ergänzungstabelle 6).
Sieben potente Leitstrukturen und das Organophosphorderivat Tamephosat wurden ausgewählt, um binäre Kombinationen ihrer LC50-Dosen im Verhältnis 1:1 herzustellen. Insgesamt wurden 28 binäre Kombinationen hergestellt und auf ihre larvizide Wirksamkeit gegen Aedes aegypti getestet. Neun Kombinationen wirkten synergistisch, 14 antagonistisch und fünf zeigten keine larvizide Wirkung. Unter den synergistischen Kombinationen erwies sich die Kombination aus Diallyldisulfid und Temofol als die wirksamste; nach 24 Stunden wurde eine Mortalität von 100 % beobachtet (Tabelle 4). Auch Mischungen aus Limonen und Diallyldisulfid sowie aus Eugenol und Thymetphos zeigten ein gutes Potenzial mit einer beobachteten Larvenmortalität von 98,3 % (Tabelle 5). Die verbleibenden vier Kombinationen – Eudesmol plus Eucalyptol, Eudesmol plus Limonen, Eucalyptol plus α-Pinen und α-Pinen plus Temephos – zeigten ebenfalls eine signifikante larvizide Wirksamkeit mit beobachteten Mortalitätsraten von über 90 %. Die erwartete Mortalitätsrate liegt bei etwa 60–75 % (Tabelle 4). Die Kombination von Limonen mit α-Pinen oder Eukalyptusöl zeigte jedoch antagonistische Reaktionen. Ebenso wirkten Mischungen von Temephos mit Eugenol, Eukalyptusöl, Eudesmol oder Diallyltrisulfid antagonistisch. Auch die Kombination von Diallyldisulfid und Diallyltrisulfid sowie die Kombination einer dieser Verbindungen mit Eudesmol oder Eugenol wirkten antagonistisch larvizid. Auch bei der Kombination von Eudesmol mit Eugenol oder α-Pinen wurde über Antagonismus berichtet.
Von allen 28 auf ihre saure Wirkung bei adulten Insekten getesteten binären Mischungen wirkten 7 synergistisch, 6 zeigten keine Wirkung und 15 wirkten antagonistisch. Mischungen aus Eudesmol und Eukalyptusöl sowie Limonen und Carvon erwiesen sich als wirksamer als andere synergistische Kombinationen, mit Mortalitätsraten von 76 % bzw. 100 % nach 24 Stunden (Tabelle 5). Malathion zeigte mit allen Kombinationen außer Limonen und Diallyltrisulfid einen synergistischen Effekt. Antagonistisch wirkten hingegen Diallyldisulfid und Diallyltrisulfid in Kombination mit Eukalyptusöl, Eucalyptol, Carvon oder Limonen. Ebenso zeigten Kombinationen von α-Pinen mit Eudesmol oder Limonen, Eucalyptol mit Carvon oder Limonen sowie Limonen mit Eudesmol oder Malathion antagonistische larvizide Wirkungen. Bei den übrigen sechs Kombinationen ergab sich kein signifikanter Unterschied zwischen erwarteter und beobachteter Mortalität (Tabelle 5).
Aufgrund synergistischer Effekte und subletaler Dosen wurde die larvizide Wirkung der Substanzen gegen eine große Anzahl von Aedes aegypti-Mücken ausgewählt und weiter untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die beobachtete Larvensterblichkeit bei den binären Kombinationen Eugenol-Limonen, Diallyldisulfid-Limonen und Diallyldisulfid-Timephos 100 % betrug, während die erwartete Larvensterblichkeit 76,48 %, 72,16 % bzw. 63,4 % betrug (Tabelle 6). Die Kombination Limonen und Eudesmol war mit einer beobachteten Larvensterblichkeit von 88 % innerhalb von 24 Stunden deutlich weniger wirksam (Tabelle 6). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die vier ausgewählten binären Kombinationen auch bei großflächiger Anwendung synergistische larvizide Effekte gegen Aedes aegypti zeigten (Tabelle 6).
Für den adultoziden Bioassay zur Bekämpfung großer Populationen adulter Aedes aegypti wurden drei synergistische Kombinationen ausgewählt. Zur Auswahl geeigneter Kombinationen für Tests an großen Insektenkolonien konzentrierten wir uns zunächst auf die beiden besten synergistischen Terpenkombinationen: Carvon plus Limonen und Eucalyptol plus Eudesmol. Anschließend wurde die beste synergistische Kombination aus dem synthetischen Organophosphat Malathion und Terpenoiden ausgewählt. Wir gehen davon aus, dass die Kombination aus Malathion und Eudesmol aufgrund der höchsten beobachteten Mortalität und der sehr niedrigen LC50-Werte der einzelnen Inhaltsstoffe die beste Wahl für Tests an großen Insektenkolonien darstellt. Malathion zeigt Synergismus in Kombination mit α-Pinen, Diallyldisulfid, Eukalyptus, Carvon und Eudesmol. Eudesmol weist jedoch mit 2,25 ppm den niedrigsten LC50-Wert auf. Die berechneten LC50-Werte von Malathion, α-Pinen, Diallyldisulfid, Eucalyptol und Carvon betrugen 5,4, 716,55, 166,02, 17,6 bzw. 140,79 ppm. Diese Werte deuten darauf hin, dass die Kombination von Malathion und Eudesmol hinsichtlich der Dosierung optimal ist. Die Ergebnisse zeigten, dass die Kombinationen von Carvon plus Limonen und Eudesmol plus Malathion eine beobachtete Mortalität von 100 % aufwiesen, verglichen mit einer erwarteten Mortalität von 61 % bis 65 %. Eine weitere Kombination, Eudesmol plus Eucalyptol, zeigte nach 24 Stunden Exposition eine Mortalitätsrate von 78,66 %, verglichen mit einer erwarteten Mortalitätsrate von 60 %. Alle drei ausgewählten Kombinationen zeigten synergistische Effekte, selbst bei großflächiger Anwendung gegen adulte Aedes aegypti (Tabelle 6).
In dieser Studie zeigten ausgewählte ätherische Pflanzenöle wie Mp, As, Os, Em und Cl vielversprechende letale Wirkungen auf die Larven- und Adultstadien von Aedes aegypti. Mp-Öl wies mit einem LC50-Wert von 0,42 ppm die höchste larvizide Aktivität auf, gefolgt von As-, Os- und Em-Öl mit einem LC50-Wert von unter 50 ppm nach 24 Stunden. Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Studien an Stechmücken und anderen Zweiflüglern überein^{10,11,12,13,14}. Obwohl die larvizide Wirkung von Cl mit einem LC50-Wert von 163,65 ppm nach 24 Stunden geringer ist als die der anderen ätherischen Öle, ist sein Potenzial gegen Adulte mit einem LC50-Wert von 23,37 ppm nach 24 Stunden am höchsten. Die ätherischen Öle Mp, As und Em zeigten ebenfalls ein gutes allergenes Potenzial mit LC50-Werten im Bereich von 100–120 ppm nach 24 Stunden Exposition, ihre larvizide Wirksamkeit war jedoch relativ geringer. Das ätherische Öl Os hingegen wies selbst bei der höchsten therapeutischen Dosis eine vernachlässigbare allergene Wirkung auf. Die Ergebnisse deuten somit darauf hin, dass die Toxizität von Ethylenoxid für Pflanzen je nach Entwicklungsstadium der Stechmücken variieren kann¹⁵. Sie hängt außerdem von der Penetrationsrate der ätherischen Öle in den Insektenkörper, ihrer Interaktion mit spezifischen Zielenzymen und der Entgiftungskapazität der Stechmücke im jeweiligen Entwicklungsstadium ab¹⁶. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass die Hauptkomponente ein wichtiger Faktor für die biologische Aktivität von Ethylenoxid ist, da sie den größten Anteil der Gesamtverbindungen ausmacht^3,12,17,18. Daher berücksichtigten wir in jedem ätherischen Öl zwei Hauptkomponenten. Basierend auf den GC-MS-Ergebnissen wurden Diallyldisulfid und Diallyltrisulfid als Hauptbestandteile des ätherischen Öls As identifiziert, was mit früheren Berichten übereinstimmt^19,20,21. Obwohl frühere Berichte Menthol als einen der Hauptbestandteile nannten, wurden Carvon und Limonen erneut als Hauptbestandteile des ätherischen Öls von Mp identifiziert^22,23. Das Zusammensetzungsprofil des ätherischen Öls von Os zeigte, dass Eugenol und Methyleugenol die Hauptbestandteile sind, was den Ergebnissen früherer Forscher ähnelt^16,24. Eucalyptol und Eucalyptol wurden als Hauptbestandteile im ätherischen Öl von Em-Blättern beschrieben, was mit den Ergebnissen einiger Forscher übereinstimmt^25,26, jedoch den Ergebnissen von Olalade et al.²⁷ widerspricht. Im ätherischen Öl von Melaleuca wurde die Dominanz von Cineol und α-Pinen beobachtet, was mit früheren Studien übereinstimmt^28,29. Innerartliche Unterschiede in der Zusammensetzung und Konzentration ätherischer Öle, die aus derselben Pflanzenart an verschiedenen Standorten extrahiert wurden, sind bekannt und wurden auch in dieser Studie beobachtet. Diese Unterschiede werden durch geografische Wachstumsbedingungen, Erntezeitpunkt, Entwicklungsstadium, Pflanzenalter und das Auftreten von Chemotypen beeinflusst.^22,30,31,32 Die identifizierten Schlüsselverbindungen wurden anschließend erworben und auf ihre larvizide Wirkung sowie ihre Wirkung auf adulte Aedes aegypti-Mücken getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass die larvizide Aktivität von Diallyldisulfid mit der von rohem ätherischem Öl vergleichbar war. Die Aktivität von Diallyltrisulfid war jedoch höher als die von ätherischem Öl. Diese Ergebnisse ähneln denen von Kimbaris et al.³³ an Culex philippines. Allerdings zeigten diese beiden Verbindungen keine gute autozide Wirkung gegen die Zielmücken, was mit den Ergebnissen von Plata-Rueda et al.³⁴ an Tenebrio molitor übereinstimmt. Ethylenoxid (Os EO) ist gegen das Larvenstadium von Aedes aegypti wirksam, nicht jedoch gegen das adulte Stadium. Es wurde festgestellt, dass die larvizide Wirkung der einzelnen Hauptbestandteile geringer ist als die von rohem Os EO. Dies deutet auf die Beteiligung weiterer Verbindungen und deren Wechselwirkungen im rohen Ethylenoxid hin. Methyleugenol allein zeigt eine vernachlässigbare Wirkung, während Eugenol allein eine moderate larvizide Wirkung aufweist. Diese Schlussfolgerung bestätigt einerseits die Ergebnisse früherer Untersuchungen^35,36, widerspricht ihnen aber andererseits^37,38. Unterschiede in den funktionellen Gruppen von Eugenol und Methyleugenol können zu unterschiedlicher Toxizität gegenüber demselben Zielinsekt führen³⁹. Limonen zeigte eine moderate larvizide Wirkung, während die Wirkung von Carvon unbedeutend war. Ebenso stützen die relativ geringe Toxizität von Limonen gegenüber adulten Insekten und die hohe Toxizität von Carvon die Ergebnisse einiger früherer Studien⁴⁰, widersprechen aber anderen⁴¹. Das Vorhandensein von Doppelbindungen sowohl intracyclischer als auch exocyclischer Positionen kann die larvizide Wirkung dieser Verbindungen erhöhen^3,41, während Carvon, ein Keton mit ungesättigten α- und β-Kohlenstoffatomen, ein höheres Toxizitätspotenzial für adulte Insekten aufweisen kann⁴². Die individuellen Eigenschaften von Limonen und Carvon sind jedoch deutlich geringer als die des gesamten ätherischen Öls Mp (Tabelle 1, Tabelle 3). Unter den getesteten Terpenoiden zeigte Eudesmol die stärkste larvizide und adulte Aktivität mit einem LC₅₀-Wert unter 2,5 ppm und ist somit eine vielversprechende Verbindung zur Bekämpfung von Aedes-Mücken. Seine Wirksamkeit ist besser als die des gesamten ätherischen Öls Em, obwohl dies nicht mit den Ergebnissen von Cheng et al.⁴⁰ übereinstimmt. Eudesmol ist ein Sesquiterpen mit zwei Isopreneinheiten, das weniger flüchtig ist als oxygenierte Monoterpene wie Eukalyptus und daher ein größeres Potenzial als Pestizid besitzt. Eucalyptol selbst zeigt eine stärkere Wirkung gegen adulte als gegen Larven, wobei frühere Studien dies sowohl bestätigen als auch widerlegen^37,43,44. Die Wirkung von Eucalyptol allein ist nahezu vergleichbar mit der des gesamten ätherischen Öls Cl. Ein weiteres bicyclisches Monoterpen, α-Pinen, hat eine geringere Wirkung auf adulte Aedes aegypti als eine larvizide Wirkung, was dem Effekt des vollständigen ätherischen Öls Cl entgegengesetzt ist. Die insektizide Gesamtwirkung von Terpenoiden wird durch ihre Lipophilie, Flüchtigkeit, Kohlenstoffverzweigung, Projektionsfläche, Oberfläche, funktionelle Gruppen und deren Positionen beeinflusst^45,46. Diese Verbindungen wirken möglicherweise durch Zerstörung von Zellansammlungen, Blockierung der Atmungsaktivität, Unterbrechung der Nervenimpulsübertragung usw.⁴⁷ Das synthetische Organophosphat Temephos wies die höchste larvizide Wirkung mit einem LC₅₀-Wert von 0,43 ppm auf, was mit den Daten von Lek-Utala übereinstimmt⁴⁸. Die Aktivität des synthetischen Organophosphor-Verbindungsstoffs Malathion bei adulten Mücken wurde bei einer Konzentration von 5,44 ppm berichtet. Obwohl diese beiden Organophosphate positive Ergebnisse gegen Laborstämme von Aedes aegypti zeigten, wurde in verschiedenen Teilen der Welt über Resistenzen gegen diese Verbindungen berichtet⁴⁹. Im Gegensatz dazu liegen keine Berichte über die Entwicklung von Resistenzen gegen pflanzliche Arzneimittel vor⁵⁰. Daher gelten pflanzliche Präparate als potenzielle Alternativen zu chemischen Pestiziden in Vektorkontrollprogrammen.
Die larvizide Wirkung wurde an 28 binären Kombinationen (1:1) aus potenten Terpenoiden und Terpenoiden mit Thymetphos getestet. Neun Kombinationen zeigten synergistische, 14 antagonistische und fünf keine Wirkung. Im Bioassay zur Wirksamkeit bei adulten Insekten erwiesen sich hingegen sieben Kombinationen als synergistisch, 15 als antagonistisch und sechs als wirkungslos. Die synergistische Wirkung bestimmter Kombinationen könnte darauf zurückzuführen sein, dass die Wirkstoffe gleichzeitig in verschiedenen wichtigen Stoffwechselwegen interagieren oder dass verschiedene Schlüsselenzyme eines bestimmten Stoffwechselwegs sequenziell gehemmt werden.⁵¹ Die Kombination von Limonen mit Diallyldisulfid, Eukalyptus oder Eugenol erwies sich sowohl in kleinen als auch in großen Anwendungsszenarien als synergistisch (Tabelle 6), während die Kombination mit Eukalyptus oder α-Pinen antagonistische Wirkungen auf Larven zeigte. Limonen scheint im Durchschnitt ein guter Synergist zu sein, möglicherweise aufgrund der vorhandenen Methylgruppen, seiner guten Penetration in das Stratum corneum und eines anderen Wirkmechanismus^52,53. Es wurde bereits berichtet, dass Limonen toxische Wirkungen durch Penetration der Insektenkutikula (Kontakttoxizität), Beeinträchtigung des Verdauungssystems (Fraßhemmer) oder des Atmungssystems (Begasungswirkung) hervorrufen kann⁵⁴, während Phenylpropanoide wie Eugenol Stoffwechselenzyme beeinflussen können⁵⁵. Daher können Kombinationen von Verbindungen mit unterschiedlichen Wirkmechanismen die Gesamtletalität der Mischung erhöhen. Eucalyptol zeigte synergistische Effekte mit Diallyldisulfid, Eukalyptus oder α-Pinen, während andere Kombinationen mit anderen Verbindungen entweder keine larvizide Wirkung hatten oder antagonistisch wirkten. Frühe Studien belegten die hemmende Wirkung von Eucalyptol auf Acetylcholinesterase (AChE) sowie auf Octaamin- und GABA-Rezeptoren⁵⁶. Da cyclische Monoterpene wie Eucalyptol und Eugenol möglicherweise denselben Wirkmechanismus wie ihre neurotoxische Wirkung aufweisen⁵⁷, werden ihre kombinierten Effekte durch gegenseitige Hemmung minimiert. Auch die Kombination von Temephos mit Diallyldisulfid, α-Pinen und Limonen erwies sich als synergistisch und bestätigte damit frühere Berichte über einen synergistischen Effekt zwischen pflanzlichen Produkten und synthetischen Organophosphaten⁵⁸.
Die Kombination von Eudesmol und Eucalyptol zeigte einen synergistischen Effekt auf die Larven- und Adultstadien von Aedes aegypti, möglicherweise aufgrund ihrer unterschiedlichen Wirkungsweisen infolge ihrer verschiedenen chemischen Strukturen. Eudesmol (ein Sesquiterpen) kann das Atmungssystem beeinflussen⁵⁹, und Eucalyptol (ein Monoterpen) kann die Acetylcholinesterase beeinflussen⁶⁰. Die gleichzeitige Exposition gegenüber den Inhaltsstoffen an zwei oder mehr Zielorten kann die letale Gesamtwirkung der Kombination verstärken. In Bioassays mit adulten Substanzen zeigte Malathion Synergieeffekte mit Carvon, Eucalyptol, Diallyldisulfid oder α-Pinen, was auf eine synergistische Wirkung mit der Zugabe von Limonen und Diallyldisulfid hindeutet. Mit Ausnahme von Allyltrisulfid stellt das gesamte Portfolio der Terpenverbindungen ein vielversprechendes synergistisches Allergenmittel dar. Thangam und Kathiresan⁶¹ berichteten ebenfalls über ähnliche Ergebnisse hinsichtlich des synergistischen Effekts von Malathion mit Pflanzenextrakten. Diese synergistische Wirkung könnte auf die kombinierte toxische Wirkung von Malathion und Phytochemikalien auf die Entgiftungsenzyme von Insekten zurückzuführen sein. Organophosphate wie Malathion wirken im Allgemeinen durch die Hemmung von Cytochrom-P450-Esterasen und Monooxygenasen^62,63,64. Daher könnte die Kombination von Malathion mit diesen Wirkmechanismen und Terpenen mit anderen Wirkmechanismen die letale Gesamtwirkung auf Mücken verstärken.
Andererseits bedeutet Antagonismus, dass die ausgewählten Verbindungen in Kombination weniger wirksam sind als jede Verbindung allein. Die Ursache für Antagonismus in einigen Kombinationen kann darin liegen, dass eine Verbindung das Verhalten der anderen durch Veränderung der Absorptions-, Verteilungs-, Metabolisierungs- oder Ausscheidungsrate beeinflusst. Frühere Forscher hielten dies für die Ursache von Antagonismus in Arzneimittelkombinationen. Moleküle Möglicher Mechanismus 65. Ähnliche mögliche Ursachen für Antagonismus können ähnliche Wirkmechanismen oder die Konkurrenz der Komponenten um denselben Rezeptor oder dieselbe Zielstruktur sein. In einigen Fällen kann auch eine nicht-kompetitive Hemmung des Zielproteins auftreten. In dieser Studie zeigten zwei Organoschwefelverbindungen, Diallyldisulfid und Diallyltrisulfid, antagonistische Wirkungen, möglicherweise aufgrund einer Konkurrenz um dieselbe Zielstruktur. Ebenso zeigten diese beiden Schwefelverbindungen antagonistische Wirkungen und waren in Kombination mit Eudesmol und α-Pinen wirkungslos. Eudesmol und α-Pinen sind cyclische Verbindungen, Diallyldisulfid und Diallyltrisulfid hingegen aliphatische. Aufgrund ihrer chemischen Struktur sollte die Kombination dieser Verbindungen die Gesamttoxizität erhöhen, da ihre Zielstrukturen üblicherweise unterschiedlich sind^34,47. Experimentell wurde jedoch ein Antagonismus beobachtet, der möglicherweise auf die Rolle dieser Verbindungen in unbekannten Organismen in vivo zurückzuführen ist. Auch die Kombination von Cineol und α-Pinen führte zu antagonistischen Reaktionen, obwohl frühere Studien gezeigt haben, dass die beiden Verbindungen unterschiedliche Wirkorte besitzen^47,60. Da es sich bei beiden Verbindungen um cyclische Monoterpene handelt, könnten gemeinsame Zielstrukturen existieren, die um die Bindung konkurrieren und die Gesamttoxizität der untersuchten Kombinationen beeinflussen.
Basierend auf den LC50-Werten und der beobachteten Mortalität wurden die beiden besten synergistischen Terpenkombinationen ausgewählt: Carvon + Limonen und Eucalyptol + Eudesmol sowie das synthetische Organophosphor-Derivat Malathion in Kombination mit Terpenen. Die optimale synergistische Kombination aus Malathion und Eudesmol wurde in einem Bioassay mit adulten Insekten getestet. Ziel waren große Insektenkolonien, um zu bestätigen, ob diese wirksamen Kombinationen auch gegen große Individuenzahlen und über relativ große Expositionsflächen wirken. Alle Kombinationen zeigten einen synergistischen Effekt gegen große Insektenschwärme. Ähnliche Ergebnisse wurden für eine optimale synergistische larvizide Kombination erzielt, die gegen große Populationen von Aedes-aegypti-Larven getestet wurde. Somit stellt die wirksame synergistische larvizide und adultizide Kombination aus ätherischen Pflanzenextrakten eine vielversprechende Alternative zu bestehenden synthetischen Chemikalien dar und kann zur Bekämpfung von Aedes-aegypti-Populationen eingesetzt werden. Ebenso können wirksame Kombinationen synthetischer Larvizide oder Adultizide mit Terpenen eingesetzt werden, um die an Mücken verabreichten Dosen von Thymetphos oder Malathion zu reduzieren. Diese potenten synergistischen Kombinationen könnten Lösungen für zukünftige Studien zur Entwicklung von Arzneimittelresistenzen bei Aedes-Mücken bieten.
Eier von Aedes aegypti wurden vom Regionalen Medizinischen Forschungszentrum Dibrugarh (Indian Council of Medical Research) gesammelt und im Zoologischen Institut der Gauhati-Universität unter kontrollierten Bedingungen (Temperatur: 28 ± 1 °C, Luftfeuchtigkeit: 85 ± 5 %) gehalten (siehe Arivoli et al.). Nach dem Schlüpfen wurden die Larven mit Larvenfutter (Hundekekspulver und Hefe im Verhältnis 3:1) und die adulten Mücken mit einer 10%igen Glucoselösung gefüttert. Ab dem dritten Tag nach dem Schlüpfen durften die adulten Weibchen Blut von Albinoratten saugen. Filterpapier wurde in einem Glas mit Wasser getränkt und in den Eierlegekäfig gelegt.
Ausgewählte Pflanzenproben, nämlich Eukalyptusblätter (Myrtaceae), Heiliges Basilikum (Lamiaceae), Minze (Lamiaceae), Teebaum (Myrtaceae) und Lauchzwiebeln (Amaryllidaceae), wurden in Guwahati gesammelt und vom Botanischen Institut der Universität Guwahati bestimmt. Die gesammelten Pflanzenproben (500 g) wurden 6 Stunden lang mittels Wasserdampfdestillation in einem Clevenger-Apparat extrahiert. Das extrahierte ätherische Öl wurde in sauberen Glasfläschchen aufgefangen und für weitere Untersuchungen bei 4 °C gelagert.
Die larvizide Toxizität wurde nach leicht modifizierten Standardverfahren der Weltgesundheitsorganisation (WHO) untersucht.⁶⁷ Als Emulgator wurde DMSO verwendet. Jede EO-Konzentration wurde zunächst bei 100 und 1000 ppm getestet, wobei jeweils 20 Larven pro Wiederholung exponiert wurden. Basierend auf den Ergebnissen wurde ein Konzentrationsbereich festgelegt und die Mortalität 1 bis 6 Stunden (in 1-Stunden-Intervallen) sowie 24, 48 und 72 Stunden nach der Behandlung erfasst. Subletale Konzentrationen (LC₅₀) wurden nach 24, 48 und 72 Stunden Expositionszeit bestimmt. Jede Konzentration wurde in dreifacher Ausführung zusammen mit einer Negativkontrolle (nur Wasser) und einer Positivkontrolle (DMSO-behandeltes Wasser) getestet. Falls Verpuppung auftritt und mehr als 10 % der Larven der Kontrollgruppe sterben, wird der Versuch wiederholt. Liegt die Mortalitätsrate in der Kontrollgruppe zwischen 5 und 10 %, wird die Abbott-Korrekturformel⁶⁸ angewendet.
Die von Ramar et al.⁶⁹ beschriebene Methode wurde für einen Bioassay an adulten Aedes aegypti-Mücken unter Verwendung von Aceton als Lösungsmittel angewendet. Jedes ätherische Öl wurde zunächst in Konzentrationen von 100 und 1000 ppm an adulten Aedes aegypti-Mücken getestet. Jeweils 2 ml der vorbereiteten Lösungen wurden auf ein Whatman-Filterpapier (12 x 15 cm²) aufgetragen und 10 Minuten lang mit Aceton benetzt. Als Kontrolle diente Filterpapier, das nur mit 2 ml Aceton behandelt worden war. Nach dem Verdunsten des Acetons wurden das behandelte und das Kontrollfilterpapier in ein zylindrisches Röhrchen (10 cm tief) gegeben. Zehn 3–4 Tage alte, nicht blutsaugende Mücken wurden in dreifacher Ausführung jeder Konzentration eingesetzt. Basierend auf den Ergebnissen der Vorversuche wurden verschiedene Konzentrationen der ausgewählten Öle getestet. Die Mortalität wurde 1, 2, 3, 4, 5, 6, 24, 48 und 72 Stunden nach dem Aussetzen der Mücken erfasst. Berechnen Sie die LC50-Werte für Expositionszeiten von 24, 48 und 72 Stunden. Übersteigt die Mortalitätsrate der Kontrollgruppe 20 %, wiederholen Sie den gesamten Test. Liegt die Mortalitätsrate in der Kontrollgruppe über 5 %, korrigieren Sie die Ergebnisse der behandelten Proben mithilfe der Abbott-Formel⁶⁸.
Zur Analyse der Inhaltsstoffe der ausgewählten ätherischen Öle wurden Gaschromatographie (Agilent 7890A) und Massenspektrometrie (AccuTOF GCv, Jeol) durchgeführt. Das GC-System war mit einem FID-Detektor und einer Kapillarsäule (HP5-MS) ausgestattet. Als Trägergas diente Helium mit einer Flussrate von 1 ml/min. Das GC-Programm setzt Allium sativum auf 10:80-1M-8-220-5M-8-270-9M und Ocimum Sainttum auf 10:80-3M-8-200-3M-10-275-1M-5 – 280, für Minze auf 10:80-1M-8-200-5M-8-275-1M-5-280, für Eukalyptus auf 20.60-1M-10-200-3M-30-280 und für Rot auf 10:60-1M-8-220-5M-8-270-3M.
Die Hauptbestandteile jedes ätherischen Öls wurden anhand des aus dem GC-Chromatogramm und den Massenspektrometrie-Ergebnissen berechneten Flächenprozentsatzes identifiziert (unter Bezugnahme auf die NIST 70-Standarddatenbank).
Die beiden Hauptbestandteile jedes ätherischen Öls wurden anhand von GC-MS-Ergebnissen ausgewählt und von Sigma-Aldrich mit einer Reinheit von 98–99 % für weitere Bioassays bezogen. Die Verbindungen wurden wie oben beschrieben auf ihre larvizide und adulte Wirksamkeit gegen Aedes aegypti getestet. Die am häufigsten verwendeten synthetischen Larvizide Tamephosat (Sigma-Aldrich) und das gegen adulte Mücken wirksame Malathion (Sigma-Aldrich) wurden analysiert, um ihre Wirksamkeit mit der der ausgewählten ätherischen Öl-Verbindungen zu vergleichen. Dabei wurde das gleiche Verfahren angewendet.
Binäre Mischungen ausgewählter Terpenverbindungen sowie von Terpenverbindungen und kommerziellen Organophosphaten (Tilephos und Malathion) wurden durch Mischen der LC50-Dosis jeder Kandidatenverbindung im Verhältnis 1:1 hergestellt. Die hergestellten Kombinationen wurden wie oben beschrieben an Larven und adulten Stadien von Aedes aegypti getestet. Jeder Bioassay wurde für jede Kombination und für jede einzelne in jeder Kombination enthaltene Verbindung dreifach durchgeführt. Das Sterben der Zielinsekten wurde nach 24 Stunden erfasst. Berechnen Sie die zu erwartende Mortalitätsrate für eine binäre Mischung mithilfe der folgenden Formel.
wobei E = erwartete Sterblichkeitsrate von Aedes aegypti-Mücken als Reaktion auf eine binäre Kombination, d.h. Verbindung (A + B).
Die Wirkung jeder binären Mischung wurde anhand des nach der von Pavla52 beschriebenen Methode berechneten χ²-Werts als synergistisch, antagonistisch oder nicht vorhanden eingestuft. Berechnen Sie den χ²-Wert für jede Kombination mithilfe der folgenden Formel.
Die Wirkung einer Kombination wurde als synergistisch definiert, wenn der berechnete χ²-Wert größer war als der Tabellenwert für die entsprechenden Freiheitsgrade (95%-Konfidenzintervall) und die beobachtete Mortalität die erwartete Mortalität überstieg. Umgekehrt gilt eine Behandlung als antagonistisch, wenn der berechnete χ²-Wert einer Kombination den Tabellenwert für einige Freiheitsgrade übersteigt, die beobachtete Mortalität jedoch niedriger als die erwartete ist. Ist der berechnete χ²-Wert einer Kombination kleiner als der Tabellenwert für die entsprechenden Freiheitsgrade, wird angenommen, dass die Kombination keine Wirkung hat.
Drei bis vier potenziell synergistische Kombinationen (100 Larven und 50 larvizide und adulte Insektenaktivität) wurden für Tests an einer großen Anzahl von Insekten ausgewählt. Die Tests an adulten Insekten wurden wie oben beschrieben durchgeführt. Neben den Mischungen wurden auch die einzelnen in den ausgewählten Mischungen enthaltenen Verbindungen an jeweils gleich vielen Larven und adulten Aedes aegypti getestet. Das Mischungsverhältnis betrug 1 Teil LC50-Dosis der einen Kandidatenverbindung und 1 Teil LC50-Dosis der anderen Komponente. Im Bioassay zur Aktivität gegen adulte Insekten wurden die ausgewählten Verbindungen in Aceton gelöst und auf Filterpapier aufgetragen, das in einem zylindrischen Kunststoffbehälter mit 1300 cm³ Volumen gelagert war. Das Aceton wurde 10 Minuten lang verdampft, und die adulten Insekten wurden freigelassen. Im Larvizid-Bioassay wurden die LC50-Dosen der Kandidatenverbindungen zunächst in gleichen Volumina DMSO gelöst und anschließend mit 1 Liter Wasser in 1300-ml-Kunststoffbehältern vermischt. Die Larven wurden dann freigelassen.
Mithilfe der Software SPSS (Version 16) und Minitab wurde eine probabilistische Analyse von 71 aufgezeichneten Mortalitätsdaten durchgeführt, um die LC50-Werte zu berechnen.