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Die Entdeckung und der nutzbringende Einsatz von Naturstoffen können das menschliche Leben verbessern. Pflanzenwachstumshemmende Chemikalien werden häufig als Herbizide zur Unkrautbekämpfung eingesetzt. Aufgrund der Notwendigkeit, verschiedene Herbizidtypen einzusetzen, besteht Bedarf an der Entwicklung von Verbindungen mit neuen Wirkmechanismen. In dieser Studie entdeckten wir eine neuartige N-Alkoxypyrrol-Verbindung, Cumamonamid, aus Streptomyces werraensis MK493-CF1 und etablierten den vollständigen Syntheseprozess. Durch biologische Aktivitätstests entdeckten wir, dass Urs-Monoaminsäure ein synthetisches Zwischenprodukt von Urs-Monoamid und ein potenziellesPflanzenwachstumshemmerDarüber hinaus haben wir verschiedene Urbenonsäure-Derivate entwickelt, darunter das Urbenyloxy-Derivat (UDA), das eine hohe herbizide Wirkung aufweist, ohne das Wachstum von HeLa-Zellen negativ zu beeinflussen. Wir fanden außerdem heraus, dass Urbenonsäure-Derivate die Mikrotubuli von Pflanzen zerstören; außerdem beeinflusst KAND Aktinfilamente und induziert Zelltod; diese vielfältigen Effekte unterscheiden sich von denen bekannter Mikrotubuli-Inhibitoren und legen einen neuen Wirkmechanismus der Ursonsäure nahe, der einen wichtigen Vorteil bei der Entwicklung neuer Herbizide darstellt.
Die Entdeckung und praktische Anwendung nützlicher Naturprodukte und ihrer Derivate trägt zur Verbesserung der menschlichen Lebensqualität bei. Sekundärmetaboliten von Mikroorganismen, Pflanzen und Insekten haben zu bedeutenden Fortschritten in Medizin und Landwirtschaft geführt. Viele Antibiotika und Leukämiemedikamente wurden aus Naturstoffen entwickelt. Darüber hinaus gibt es verschiedene Arten vonPestizideAus diesen Naturstoffen werden Fungizide und Herbizide für die Landwirtschaft gewonnen. Insbesondere Herbizide zur Unkrautbekämpfung sind wichtige Instrumente zur Steigerung der Ernteerträge in der modernen Landwirtschaft, und verschiedene Arten von Verbindungen werden bereits kommerziell eingesetzt. Verschiedene zelluläre Prozesse in Pflanzen, wie Photosynthese, Aminosäurestoffwechsel, Zellwandsynthese, Mitoseregulation, Phytohormonsignalisierung oder Proteinsynthese, gelten als typische Angriffspunkte von Herbiziden. Verbindungen, die die Mikrotubuli-Funktion hemmen, sind eine häufige Herbizidklasse, die das Pflanzenwachstum durch Beeinflussung der Mitoseregulation beeinflusst2.
Mikrotubuli sind Bestandteile des Zytoskeletts und in eukaryotischen Zellen weitgehend konserviert. Das Tubulin-Heterodimer besteht aus α-Tubulin und β-Tubulin, die lineare Mikrotubuli-Protofilamente bilden, wobei 13 Protofilamente eine zylindrische Struktur bilden. Mikrotubuli spielen in Pflanzenzellen mehrere Rollen, unter anderem bestimmen sie die Zellform, die Zellteilung und den intrazellulären Transport3,4. Pflanzenzellen enthalten Mikrotubuli unterhalb der Interphasenplasmamembran, und diese sogenannten kortikalen Mikrotubuli steuern vermutlich die Organisation von Cellulose-Mikrofibrillen durch die Regulierung von Cellulose-Synthase-Komplexen4,5. Kortikale Mikrotubuli von Wurzelepidermiszellen, die in der Zone schnellen Wachstums der Wurzelspitze vorhanden sind, liegen lateral, und Cellulose-Mikrofasern folgen diesen Mikrotubuli und begrenzen die Richtung der Zellexpansion, wodurch sie ein anisotropes Zellwachstum fördern. Die Funktion der Mikrotubuli ist daher eng mit der Pflanzenmorphologie verbunden. Aminosäuresubstitutionen in Tubulin-kodierenden Genen führen zu einer Schiefstellung der kortikalen Mikrotubuli-Anordnung und zu links- oder rechtsseitigem Wachstum in Arabidopsis 6,7. Ebenso können Mutationen in Mikrotubuli-assoziierten Proteinen, die die Mikrotubuli-Dynamik regulieren, zu einem gestörten Wurzelwachstum führen8,9,10,11,12,13. Auch die Behandlung mit mikrotubuli-disruptierenden Herbiziden wie Disopyramid, auch bekannt als Pretilachlor, führt zu linksseitigem, schrägem Wurzelwachstum14. Diese Daten zeigen, dass die präzise Regulierung der Mikrotubuli-Funktion entscheidend für die Richtung des Pflanzenwachstums ist.
Es wurden verschiedene Arten von Mikrotubuli-Inhibitoren entdeckt, die wichtige Beiträge zur Zytoskelettforschung sowie zur Landwirtschaft und Medizin geleistet haben.2 Insbesondere Oryzalin, Dinitroanilinverbindungen, Disopyramid, Benzamid-verwandte Verbindungen und deren Analoga können die Mikrotubuli-Funktion und damit das Pflanzenwachstum hemmen. Daher werden sie häufig als Herbizide eingesetzt. Da Mikrotubuli jedoch ein wichtiger Bestandteil pflanzlicher und tierischer Zellen sind, wirken die meisten Mikrotubuli-Inhibitoren für beide Zelltypen zytotoxisch. Daher werden trotz ihres anerkannten Nutzens als Herbizide nur wenige Antimikrotubuli-Wirkstoffe in der Praxis eingesetzt.
Streptomyces ist eine Gattung der Familie Streptomyces, die aerobe, grampositive, filamentöse Bakterien umfasst und weithin für ihre Fähigkeit bekannt ist, ein breites Spektrum an Sekundärmetaboliten zu produzieren. Daher gilt sie als eine der wichtigsten Quellen für neue biologisch aktive Naturstoffe. In der vorliegenden Studie haben wir eine neue Verbindung namens Coumamonamid entdeckt, die aus Streptomyces werraensis MK493-CF1 und S. werraensis ISP 5486 isoliert wurde. Mittels Spektralanalyse und Vollspektralanalyse wurde die Struktur von Coumamonamid charakterisiert und sein einzigartiges N-Alkoxypyrrol-Gerüst bestimmt. Synthese. Es wurde festgestellt, dass Ursmonsäure, ein synthetisches Zwischenprodukt von Ursmonoamid und seinen Derivaten, das Wachstum und die Keimung der beliebten Modellpflanze Arabidopsis thaliana hemmt. In einer Studie zur Struktur-Wirkungs-Beziehung haben wir festgestellt, dass eine Verbindung mit zu Ursonsäure modifiziertem C9, das sogenannte Nonyloxy-Derivat der Ursonsäure (KAND), die hemmende Wirkung auf Wachstum und Keimung signifikant verstärkt. Bemerkenswerterweise beeinflusste der neu entdeckte Pflanzenwachstumshemmer auch das Wachstum von Tabak und Lebermoos und war weder für Bakterien noch für HeLa-Zellen zytotoxisch. Darüber hinaus induzieren einige Derivate der Urmotonsäure einen verzerrten Wurzelphänotyp, was darauf hindeutet, dass diese Derivate direkt oder indirekt die Mikrotubuli beeinflussen. In Übereinstimmung mit dieser Idee deuten unsere Beobachtungen von Mikrotubuli, die entweder immunhistochemisch oder mit fluoreszierenden Proteinen markiert wurden, darauf hin, dass die KAND-Behandlung Mikrotubuli depolymerisiert. Darüber hinaus zerstörte die Behandlung mit Derivaten der Kumamotonsäure Aktin-Mikrofilamente. Somit haben wir einen neuen Pflanzenwachstumshemmer entdeckt, dessen einzigartiger Wirkmechanismus die Zerstörung des Zytoskeletts beinhaltet.
Der Stamm MK493-CF1 wurde aus Erde in Shinagawa-ku, Tokio, isoliert. Der Stamm MK493-CF1 bildete ein gut verzweigtes Stromamyzel. Die Partialsequenz des 16S-ribosomalen RNA-Gens (1422 bp) wurde bestimmt. Dieser Stamm ist S. werraensis sehr ähnlich (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: typischer Stamm, 99,93 %). Basierend auf diesem Ergebnis wurde festgestellt, dass dieser Stamm eng mit dem Typstamm von S. werraensis verwandt ist. Daher haben wir diesen Stamm vorläufig S. werraensis MK493-CF1 genannt. S. werraensis ISP 5486T produziert auch die gleichen bioaktiven Verbindungen. Da es anfänglich kaum Forschung zur Gewinnung von Naturstoffen aus diesem Mikroorganismus gab, wurden weitere chemische Untersuchungen durchgeführt. Nach der Kultivierung von S. werraensis MK493-CF1 auf Gerstenmedium mittels Feststofffermentation bei 30 °C für 14 Tage wurde das Medium mit 50 %igem EtOH extrahiert. 60 ml der Probe wurden getrocknet, um 59,5 mg Rohextrakt zu erhalten. Der Rohextrakt wurde mittels Umkehrphasen-HPLC analysiert, um N-Methoxy-1H-pyrrol-2-carboxamid (1, genannt Cumamonamid, 36,0 mg) zu erhalten. Die Gesamtmenge von 1 beträgt etwa 60 % des Rohextrakts. Daher haben wir uns entschlossen, die Eigenschaften von Kumamotoamid 1 detailliert zu untersuchen.
Cumamonamid 1 ist ein weißes amorphes Pulver und hochauflösende Massenspektrometrie (HRESIMS) bestätigt C6H8N2O2 (Abb. 1). Das C2-substituierte Pyrrolfragment dieser Verbindung ist charakterisiert durch δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH im 1H-NMR-Spektrum: 4,5 Hz, H-5) und δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), und das 13C-NMR-Spektrum zeigt das Vorhandensein von vier sp2-Kohlenstoffatomen. Das Vorhandensein einer Amidgruppe an der C2-Position wurde durch HMBC-Korrelation vom C-3-Proton zum Amidcarbonylkohlenstoff bei δC 161,1 ermittelt. Darüber hinaus deuten 1 H- und 13 C-NMR-Spektren bei δH 4,10 (3H, S) und δC 68,3 auf das Vorhandensein von N-Methoxygruppen im Molekül hin. Obwohl die korrekte Position der Methoxygruppe mithilfe spektroskopischer Analysen wie verstärkter Differenzspektroskopie und Kern-Overhauser-Abkürzung (NOEDF) noch nicht bestimmt worden war, wurde N-Methoxy-1H-pyrrol-2-carboxamid als erste Kandidatenverbindung ausgewählt.
Um die korrekte Struktur von 1 zu bestimmen, wurde eine Totalsynthese durchgeführt (Abb. 2a). Behandlung des im Handel erhältlichen 2-Aminopyridins 2 mit m-CPBA führte in quantitativer Ausbeute zum entsprechenden N-Oxid 3. Nach der 2-Aminoazidierung von 2 wurde die von Abramovich beschriebene Cyclokondensationsreaktion in Benzol bei 90 °C durchgeführt, um das gewünschte 1-Hydroxy-1H-pyrrol-2-carbonitril 5 in Gramm zu erhalten. Geschwindigkeit 60 % (zwei Stufen). 15,16. Methylierung und Hydrolyse von 4 ergaben dann 1-Methoxy-1H-pyrrol-2-carbonsäure (genannt „Kumamotonsäure“, 6) in guter Ausbeute (70 %, zwei Stufen). Schließlich ergab Amidierung über das Säurechlorid-Zwischenprodukt 6 unter Verwendung von wässrigem Ammoniak das Kumamoto-Amid 1 in 98 % Ausbeute. Alle Spektraldaten des synthetisierten 1 waren denen des isolierten 1 ähnlich, sodass die Struktur von 1 bestimmt war;
Allgemeine Synthese und Analyse der biologischen Aktivität von Urbenamid und Urbensäure. (a) Totalsynthese von Kumamoto-Amid. (b) Sieben Tage alte Sämlinge des Wildtyps Arabidopsis Columbia (Col) wurden auf Murashige- und Skoog-Platten (MS) gezüchtet, die Cumamonamid 6 oder Cumamonamid 1 in den angegebenen Konzentrationen enthielten. Maßstab = 1 cm.
Zunächst untersuchten wir die biologischen Aktivitäten von Urbenamid und seinen Zwischenprodukten auf ihre Fähigkeit, das Pflanzenwachstum zu modulieren. Wir gaben MS-Agarmedium verschiedene Konzentrationen von Ursmonamid 1 oder Ursmonsäure 6 hinzu und kultivierten Arabidopsis thaliana-Setzlinge auf diesem Medium. Diese Tests zeigten, dass hohe Konzentrationen (500 μM) von 6 das Wurzelwachstum hemmten (Abb. 2b). Anschließend erzeugten wir verschiedene Derivate durch Substitution der N1-Position von 6 und untersuchten mit ihnen die Struktur-Wirkungs-Beziehung (der analoge Syntheseprozess ist in den Zusatzinformationen (SI) beschrieben). Arabidopsis-Setzlinge wurden auf einem Medium mit 50 μM Ursonsäurederivaten gezüchtet und die Wurzellänge gemessen (siehe Abbildung). Wie in Abbildung 3a, b und S1 dargestellt, weisen Cumamosäuren an der N1-Position lineare Alkoxyketten unterschiedlicher Länge (9, 10, 11, 12 und 13) oder große Alkoxyketten (15, 16 und 17) auf. Die Derivate zeigten eine signifikante Hemmung des Wurzelwachstums. Darüber hinaus stellten wir fest, dass die Anwendung von 200 μM 10, 11 oder 17 die Keimung hemmte (Abbildung 3c und S2).
Untersuchung der Struktur-Wirkungs-Beziehung von Kumamotoamid und verwandten Verbindungen. (a) Struktur und Syntheseschema von Analoga. (b) Quantifizierung der Wurzellänge von 7 Tage alten Sämlingen, die auf MS-Medium mit oder ohne 50 μM Cumamonamid-Derivate gewachsen sind. Sternchen zeigen signifikante Unterschiede zur Scheinbehandlung an (t-Test, p< 0,05). n>18. Die Daten sind als Mittelwert ± SD dargestellt. nt bedeutet „nicht getestet“, da mehr als 50 % der Samen nicht keimten. (c) Quantifizierung der Keimrate behandelter Samen, die 7 Tage lang in MS-Medium mit oder ohne 200 μM Cumamonamid und verwandten Verbindungen inkubiert wurden. Sternchen zeigen signifikante Unterschiede zur Scheinbehandlung an (Chi-Quadrat-Test). n=96.
Interessanterweise verringerte die Hinzufügung von Alkylseitenketten, die länger als C9 waren, die Hemmaktivität, was darauf schließen lässt, dass mit Kumamotosäure verwandte Verbindungen Seitenketten einer bestimmten Größe benötigen, um ihre biologische Aktivität zu entfalten.
Da die Analyse der Struktur-Wirkungs-Beziehung zeigte, dass C9 zu Ursonsäure modifiziert wurde und das Nonyloxyderivat der Ursonsäure (nachfolgend KAND 11 genannt) der wirksamste Wachstumshemmer war, untersuchten wir KAND 11 genauer. Die Behandlung von Arabidopsis mit 50 μM KAND 11 verhinderte die Keimung fast vollständig, während niedrigere Konzentrationen (40, 30, 20 oder 10 μM) von KAND 11 das Wurzelwachstum dosisabhängig hemmten (Abb. 4a, b). Um zu testen, ob KAND 11 die Lebensfähigkeit des Wurzelmeristems beeinflusst, untersuchten wir mit Propidiumiodid (PI) gefärbte Wurzelmeristeme und maßen die Meristemfläche. Die Meristemgröße von Sämlingen, die auf einem Medium mit 25 μM KAND-11 gewachsen sind, betrug 151,1 ± 32,5 μm, während die Meristemgröße von Sämlingen, die auf einem Kontrollmedium mit DMSO gewachsen sind, 264,7 ± 30,8 μm betrug (Abb. 4c, d). Dies weist darauf hin, dass KAND-11 die Zellaktivität wiederherstellt. Ausbreitung. Wurzelmeristem. In Übereinstimmung damit reduzierte die Behandlung mit KAND-11 die Menge des Zellteilungsmarkers CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS-Signals im Wurzelmeristem (Abb. 4e) 17. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass KAND-11 das Wurzelwachstum durch Verringerung der Zellproliferationsaktivität hemmt.
Analyse der hemmenden Wirkung von Urbenonsäurederivaten (Urbenyloxyderivaten) auf das Wachstum. (a) 7 Tage alte Wildtyp-Col-Sämlinge, gewachsen auf MS-Platten mit den angegebenen Konzentrationen von KAND 11. Maßstab = 1 cm. (b) Quantifizierung der Wurzellänge. Buchstaben zeigen signifikante Unterschiede an (Tukey-HSD-Test, p< 0,05). n>16. Die Daten sind als Mittelwert ± SD dargestellt. (c) Konfokalmikroskopie von Propidiumiodid-gefärbten Wildtyp-Col-Wurzeln, gewachsen auf MS-Platten mit oder ohne 25 μM KAND 11. Weiße Klammern kennzeichnen das Wurzelmeristem. Maßstab = 100 μm. (d) Quantifizierung der Wurzelmeristemgröße (n = 10 bis 11). Statistische Unterschiede wurden mittels t-Test (p< 0,05). Die Balken stellen die durchschnittliche Meristemgröße dar. (e) Differentielle Interferenzkontrastmikroskopie (DIC) eines Wurzelmeristems, das das CDKB2-Konstrukt enthält; 1pro: CDKB2; 1-GUS gefärbt und gefärbt auf 5 Tage alten Sämlingen, die auf MS-Platten mit oder ohne 25 µM KAND-Test gewachsen sind.
Die Phytotoxizität von KAND 11 wurde zusätzlich an einer anderen zweikeimblättrigen Pflanze, Tabak (Nicotiana tabacum), und einem wichtigen Landpflanzen-Modellorganismus, Lebermoos (Marchantia polymorpha), getestet. Wie bei Arabidopsis bildeten Tabak-SR-1-Keimlinge, die auf einem Medium mit 25 μM KAND 11 gewachsen waren, kürzere Wurzeln (Abb. 5a). Zusätzlich keimten 40 von 48 Samen auf Platten mit 200 μM KAND 11, während alle 48 Samen auf scheinbehandeltem Medium keimten. Dies deutet darauf hin, dass höhere KAND-Konzentrationen signifikant waren (p< 0,05; Chi-Test -Quadrat) hemmte die Keimung von Tabak (Abb. 5b). Zudem war die Konzentration von KAND 11, die das Bakterienwachstum in Lebermoos hemmte, ähnlich der wirksamen Konzentration in Arabidopsis (Abb. 5c). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass KAND 11 das Wachstum einer Reihe von Pflanzen hemmen kann. Wir untersuchten dann die mögliche Zytotoxizität von mit Bear-Monoamid verwandten Verbindungen in anderen Organismen, nämlich menschlichen HeLa-Zellen und Escherichia coli Stamm DH5α als Vertretern höherer Tier- bzw. Bakterienzellen. In einer Reihe von Zellproliferationstests beobachteten wir, dass Cumamonamid 1, Cumamonamidsäure 6 und KAND 11 in Konzentrationen von 100 μM das Wachstum von HeLa- oder E. coli-Zellen nicht beeinflussten (Abb. 5d,e).
Wachstumshemmung von KAND 11 in Nicht-Arabidopsis-Organismen. (a) Zwei Wochen alte Wildtyp-SR-1-Tabaksetzlinge wurden auf vertikal positionierten MS-Platten mit 25 μM KAND 11 gezüchtet. (b) Zwei Wochen alte Wildtyp-SR-1-Tabaksetzlinge wurden auf horizontal positionierten MS-Platten mit 200 μM KAND 11 gezüchtet. (c) Zwei Wochen alte Wildtyp-Tak-1-Lebermoosknospen, gezüchtet auf Gamborg-B5-Platten mit den angegebenen KAND 11-Konzentrationen. Rote Pfeile zeigen Sporen an, die innerhalb der zweiwöchigen Inkubationszeit ihr Wachstum einstellten. (d) Zellproliferationstest von HeLa-Zellen. Die Zahl lebender Zellen wurde in festgelegten Zeitabständen mit einem Cell Counting Kit 8 (Dojindo) gemessen. Zur Kontrolle wurden HeLa-Zellen mit 5 μg/ml Actinomycin D (Act D) behandelt, das die Transkription der RNA-Polymerase hemmt und Zelltod verursacht. Die Analysen wurden dreifach durchgeführt. (e) E. coli-Zellproliferationstest. Das E. coli-Wachstum wurde mittels OD600-Messung analysiert. Zur Kontrolle wurden die Zellen mit 50 μg/ml Ampicillin (Amp) behandelt, welches die bakterielle Zellwandsynthese hemmt. Die Analysen wurden dreifach durchgeführt.
Um den Wirkungsmechanismus der durch Uramid-verwandte Verbindungen verursachten Zytotoxizität zu entschlüsseln, haben wir Urbensäurederivate mit mäßigen Hemmeffekten erneut analysiert, wie auf dem Bild gezeigt. Wie in den Abbildungen 2b und 6a gezeigt, bildeten Setzlinge, die auf Agarplatten mit hohen Konzentrationen (200 μM) Urmotonsäure 6 gewachsen waren, kürzere und nach links gekrümmte Wurzeln (θ = – 23,7 ± 6,1), während Setzlinge, die auf dem Kontrollmedium gewachsen waren, fast gerade Wurzeln bildeten (θ = – 3,8 ± 7,1). Dieses charakteristische schräge Wachstum ist bekanntermaßen auf eine Funktionsstörung der kortikalen Mikrotubuli zurückzuführen14,18. In Übereinstimmung mit diesem Befund induzierten die Mikrotubuli-destabilisierenden Medikamente Disopyramid und Oryzalin unter unseren Wachstumsbedingungen eine ähnliche Wurzelneigung (Abb. 2b, 6a). Gleichzeitig testeten wir Urmotonsäurederivate und wählten mehrere davon aus, die in bestimmten Konzentrationen schräges Wurzelwachstum verursachten. Die Verbindungen 8, 9 und 15 veränderten die Richtung des Wurzelwachstums bei 75 µM, 50 µM bzw. 40 µM, was darauf hindeutet, dass diese Verbindungen Mikrotubuli wirksam destabilisieren können (Abb. 2b, 6a). Wir testeten auch das wirksamste Ursolsäurederivat, KAND 11, in einer niedrigeren Konzentration (15 µM) und stellten fest, dass die Anwendung von KAND 11 das Wurzelwachstum hemmte und dass die Richtung des Wurzelwachstums ungleichmäßig war, obwohl die Wurzeln dazu neigten, nach links abzufallen (Abbildung C3). Da höhere Konzentrationen Mikrotubuli-destabilisierender Medikamente manchmal das Pflanzenwachstum hemmen, anstatt eine Neigung der Wurzeln zu verursachen, untersuchten wir anschließend die Möglichkeit, dass KAND 11 Mikrotubuli beeinflusst, indem wir kortikale Mikrotubuli in Wurzelepidermiszellen beobachteten. Immunhistochemische Untersuchungen mit Anti-β-Tubulin-Antikörpern in Epidermiszellen von Keimlingswurzeln, die mit 25 μM KAND 11 behandelt wurden, zeigten das Verschwinden nahezu aller kortikalen Mikrotubuli in Epidermiszellen in der Streckungszone (Abb. 6b). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Kumamotonsäure und ihre Derivate direkt oder indirekt auf Mikrotubuli wirken und diese zerstören. Diese Verbindungen sind neuartige Mikrotubuli-Inhibitoren.
Ursonsäure und ihre Derivate verändern die kortikalen Mikrotubuli in Arabidopsis thaliana. (a) Wurzelneigungswinkel gemessen in Gegenwart verschiedener Urmotonsäurederivate in den angegebenen Konzentrationen. Die Wirkung zweier bekannter mikrotubulihemmender Verbindungen, Disopyramid und Oryzalin, wurde ebenfalls analysiert. Der Einschub zeigt den Standard zur Messung des Wurzelwachstumswinkels. Sternchen zeigen signifikante Unterschiede zur Scheinbehandlung an (t-Test, p< 0,05). n>19. Maßstab = 1 cm. (b) Kortikale Mikrotubuli in Epidermiszellen in der Streckungszone. Mikrotubuli in Wildtyp-Arabidopsis-Col-Wurzeln, die auf MS-Platten mit oder ohne 25 μM KAND 11 gewachsen sind, wurden durch immunhistochemische Färbung mit β-Tubulin-Primärantikörpern und Alexa-Fluor-konjugierten Sekundärantikörpern visualisiert. Maßstab = 10 µm. (c) Mitotische Struktur von Mikrotubuli im Wurzelmeristem. Mikrotubuli wurden mittels immunhistochemischer Färbung visualisiert. Mitotische Strukturen, einschließlich Prophasezonen, Spindeln und Phragmoplasten, wurden anhand konfokaler Bilder gezählt. Pfeile kennzeichnen mitotische Mikrotubuli-Strukturen. Sternchen zeigen signifikante Unterschiede zur Scheinbehandlung an (t-Test, p< 0,05). n>9. Maßstab = 50 µm.
Obwohl Ursa die Fähigkeit besitzt, die Mikrotubuli-Funktion zu stören, wird erwartet, dass sein Wirkmechanismus sich von dem typischer Mikrotubuli-Depolymerisate unterscheidet. So induzieren beispielsweise höhere Konzentrationen von Mikrotubuli-Depolymerisatoren wie Disopyramid und Oryzalin eine anisotrope Expansion von Epidermiszellen, während dies bei KAND 11 nicht der Fall ist. Darüber hinaus führte die gleichzeitige Anwendung von KAND 11 und Disopyramid zu einer kombinierten Disopyramid-induzierten Wurzelwachstumsreaktion, und es wurde eine KAND 11-induzierte Wachstumshemmung beobachtet (Abb. S4). Wir analysierten außerdem die Reaktion des hypersensitiven Disopyramid 1-1 (phs1-1)-Mutanten auf KAND 11. phs1-1 weist eine nicht-kanonische Tubulinkinase-Punktmutation auf und bildet bei Behandlung mit Disopyramid9,20 kürzere Wurzeln. Setzlinge des phs1-1-Mutanten, die auf Agarmedium mit KAND 11 gewachsen sind, hatten ähnlich kurze Wurzeln wie die auf Disopyramid gewachsenen (Abb. S5).
Darüber hinaus beobachteten wir mitotische Mikrotubuli-Strukturen wie Prophasezonen, Spindeln und Phragmoplasten im Wurzelmeristem von Sämlingen, die mit KAND 11 behandelt wurden. In Übereinstimmung mit den Beobachtungen für CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS wurde eine signifikante Abnahme der Anzahl mitotischer Mikrotubuli festgestellt (Abb. 6c).
Um die Zytotoxizität von KAND 11 bei subzellulärer Auflösung zu charakterisieren, behandelten wir Tabak-BY-2-Suspensionszellen mit KAND 11 und beobachteten ihre Reaktion. Um die Wirkung von KAND 11 auf kortikale Mikrotubuli zu beurteilen, gaben wir zunächst KAND 11 zu BY-2-Zellen, die TagRFP-TUA6 exprimieren, welches Mikrotubuli fluoreszenzmarkiert. Die Dichte der kortikalen Mikrotubuli wurde mittels Bildanalyse ermittelt, die den Prozentsatz der Zytoskelettpixel unter den Zytoplasmapixeln quantifizierte. Die Testergebnisse zeigten, dass nach einer Behandlung mit 50 μM oder 100 μM KAND 11 über eine Stunde die Dichte signifikant auf 0,94 ± 0,74 % bzw. 0,23 ± 0,28 % abnahm, während die Dichte der mit DMSO behandelten Zellen 1,61 ± 0,34 % betrug (Abb. 7a). Diese Ergebnisse stimmen mit der Beobachtung in Arabidopsis überein, dass die Behandlung mit KAND 11 die Depolymerisation kortikaler Mikrotubuli induziert (Abb. 6b). Wir untersuchten auch die BY-2-Linie mit GFP-ABD-markierten Aktinfilamenten nach Behandlung mit der gleichen Konzentration von KAND 11 und beobachteten, dass die Behandlung mit KAND 11 die Aktinfilamente zerstörte. Die Behandlung mit 50 μM oder 100 μM KAND 11 für 1 Stunde reduzierte die Aktinfilamentdichte signifikant auf 1,20 ± 0,62 % bzw. 0,61 ± 0,26 %, während die Dichte in DMSO-behandelten Zellen 1,69 ± 0,51 % betrug (Abb. 7b). Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu den Wirkungen von Propyzamid, das Aktinfilamente nicht beeinflusst, und Latrunculin B, einem Aktin-Depolymerisierer, der Mikrotubuli nicht beeinflusst (SI Abbildung S6). Darüber hinaus hatte die Behandlung mit Cumamonamid 1, Cumamonamidsäure 6 oder KAND 11 keine Auswirkungen auf die Mikrotubuli in HeLa-Zellen (SI Abbildung S7). Daher wird angenommen, dass sich der Wirkmechanismus von KAND 11 von dem bekannter Zytoskelett-Disruptoren unterscheidet. Darüber hinaus enthüllte unsere mikroskopische Beobachtung von mit KAND 11 behandelten BY-2-Zellen den Beginn des Zelltods während der KAND 11-Behandlung und zeigte, dass der Anteil der mit Evans-Blau gefärbten toten Zellen nach 30-minütiger KAND 11-Behandlung nicht signifikant anstieg, während nach 90-minütiger Behandlung mit 50 μM oder 100 μM KAND die Anzahl der toten Zellen auf 43,7 % bzw. 80,1 % anstieg (Abb. 7c). Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass das neue Ursolsäurederivat KAND 11 ein pflanzenspezifischer Zytoskelett-Inhibitor mit einem bisher unbekannten Wirkmechanismus ist.
KAND beeinflusst kortikale Mikrotubuli, Aktinfilamente und die Lebensfähigkeit von Tabak-BY-2-Zellen. (a) Visualisierung kortikaler Mikrotubuli in BY-2-Zellen in Gegenwart von TagRFP-TUA6. BY-2-Zellen, die mit KAND 11 (50 μM oder 100 μM) oder DMSO behandelt wurden, wurden mittels Konfokalmikroskopie untersucht. Die kortikale Mikrotubulidichte wurde aus Mikroaufnahmen von 25 unabhängigen Zellen berechnet. Buchstaben zeigen signifikante Unterschiede an (Tukey-HSD-Test, p< 0,05). Maßstab = 10 µm. (b) Kortikale Aktinfilamente in BY-2-Zellen, visualisiert in Gegenwart von GFP-ABD2. BY-2-Zellen, behandelt mit KAND 11 (50 µM oder 100 µM) oder DMSO, wurden mittels konfokaler Mikroskopie untersucht. Die Dichte der kortikalen Aktinfilamente wurde aus Mikrofotografien von 25 unabhängigen Zellen berechnet. Buchstaben zeigen signifikante Unterschiede an (Tukey-HSD-Test, p< 0,05). Maßstab = 10 µm. (c) Beobachtung toter BY-2-Zellen mittels Evans-Blau-Färbung. Mit KAND 11 (50 µM oder 100 µM) oder DMSO behandelte BY-2-Zellen wurden mittels Hellfeldmikroskopie untersucht. n=3. Maßstab = 100 µm.
Die Entdeckung und Anwendung neuer Naturprodukte hat zu bedeutenden Fortschritten in verschiedenen Bereichen des menschlichen Lebens geführt, einschließlich Medizin und Landwirtschaft. In der Vergangenheit wurde geforscht, um nützliche Verbindungen aus natürlichen Ressourcen zu gewinnen. Insbesondere Actinomyceten sind als nützliche antiparasitäre Antibiotika gegen Nematoden bekannt, da sie verschiedene Sekundärmetaboliten wie Avermectin, die Leitverbindung von Ivermectin, sowie Bleomycin und dessen Derivate produzieren, die medizinisch als Mittel gegen Krebs eingesetzt werden21,22. Ebenso wurden verschiedene herbizide Verbindungen aus Actinomyceten entdeckt, von denen einige bereits kommerziell genutzt werden1,23. Daher gilt die Analyse von Actinomyceten-Metaboliten zur Isolierung von Naturprodukten mit gewünschten biologischen Aktivitäten als effektive Strategie. In dieser Studie haben wir eine neue Verbindung, Coumamonamid, aus S. werraensis entdeckt und erfolgreich synthetisiert. Ursonsäure ist ein synthetisches Zwischenprodukt von Urbenamid und seinen Derivaten. Es kann zu einer charakteristischen Wurzelkräuselung führen, eine mäßige bis starke herbizide Wirkung aufweisen und die Mikrotubuli der Pflanze direkt oder indirekt schädigen. Der Wirkungsmechanismus der Urmotonsäure unterscheidet sich jedoch möglicherweise von dem bestehender Mikrotubuli-Inhibitoren, da KAND 11 ebenfalls Aktinfilamente zerstört und Zelltod verursacht. Dies deutet auf einen Regulationsmechanismus hin, durch den Urmotonsäure und ihre Derivate ein breites Spektrum von Zytoskelettstrukturen beeinflussen.
Eine weitere detaillierte Charakterisierung der Urbenonsäure wird dazu beitragen, deren Wirkungsmechanismus besser zu verstehen. Insbesondere ist das nächste Ziel die Bewertung der Fähigkeit der Ursonsäure, an reduzierte Mikrotubuli zu binden, um festzustellen, ob Ursonsäure und ihre Derivate direkt auf Mikrotubuli wirken und diese depolymerisieren oder ob ihre Wirkung zu einer Destabilisierung der Mikrotubuli führt. Falls Mikrotubuli kein direktes Ziel sind, wird die Identifizierung des Wirkorts und der molekularen Ziele der Ursonsäure auf Pflanzenzellen außerdem dazu beitragen, die Eigenschaften verwandter Verbindungen und mögliche Wege zur Verbesserung der herbiziden Wirkung besser zu verstehen. Unser Bioaktivitätstest zeigte die einzigartige zytotoxische Wirkung der Ursonsäure auf das Wachstum von Pflanzen wie Arabidopsis thaliana, Tabak und Lebermoos, während weder E. coli noch HeLa-Zellen beeinträchtigt wurden. Die geringe oder nicht vorhandene Toxizität für tierische Zellen ist ein Vorteil von Ursonsäurederivaten, wenn sie als Herbizide für den Einsatz in offenen landwirtschaftlichen Feldern entwickelt werden. Da Mikrotubuli bei Eukaryoten häufig vorkommen, ist ihre selektive Hemmung in Pflanzen eine wichtige Voraussetzung für Herbizide. Beispielsweise wird Propyzamid, ein Mikrotubuli-Depolymerisat, das direkt an Tubulin bindet und die Polymerisation hemmt, aufgrund seiner geringen Toxizität für tierische Zellen als Herbizid eingesetzt24. Im Gegensatz zu Disopyramid haben verwandte Benzamide andere Zielspezifitäten. Neben pflanzlichen Mikrotubuli hemmt RH-4032 oder Benzoxamid auch Mikrotubuli tierischer Zellen bzw. Oomyceten, und Zalilamid wird aufgrund seiner geringen Phytotoxizität als Fungizid eingesetzt25,26,27. Der neu entdeckte Bear und seine Derivate zeigen selektive Zytotoxizität gegen Pflanzen, es ist jedoch anzumerken, dass weitere Modifikationen ihre Zielspezifität verändern und möglicherweise zusätzliche Derivate zur Bekämpfung pathogener Pilze oder Oomyceten bereitstellen können.
Die einzigartigen Eigenschaften der Urbenonsäure und ihrer Derivate sind für ihre Entwicklung als Herbizide und ihre Verwendung als Forschungsinstrumente nützlich. Die Bedeutung des Zytoskeletts bei der Kontrolle der Zellform von Pflanzen ist allgemein anerkannt. Frühere Studien haben gezeigt, dass Pflanzen komplexe Mechanismen der kortikalen Mikrotubuli-Organisation entwickelt haben, indem sie die Mikrotubuli-Dynamik kontrollieren, um die Morphogenese angemessen zu steuern. Es wurde eine große Zahl von Molekülen identifiziert, die für die Regulierung der Mikrotubuli-Aktivität verantwortlich sind, und die entsprechende Forschung ist noch im Gange3,4,28. Unser derzeitiges Verständnis der Mikrotubuli-Dynamik in Pflanzenzellen erklärt die Mechanismen der kortikalen Mikrotubuli-Organisation nicht vollständig. Beispielsweise können zwar sowohl Disopyramid als auch Oryzalin Mikrotubuli depolymerisieren, Disopyramid verursacht jedoch schwere Wurzeldeformationen, während Oryzalin einen relativ milden Effekt hat. Überdies verursachen Mutationen im Tubulin, das die Mikrotubuli stabilisiert, auch eine Rechtsrotation der Wurzeln, während dies bei Paclitaxel, das ebenfalls die Mikrotubuli-Dynamik stabilisiert, nicht der Fall ist. Die Untersuchung und Identifizierung der molekularen Angriffspunkte der Ursolsäure dürfte daher neue Erkenntnisse zur Regulation kortikaler Mikrotubuli in Pflanzen liefern. Ebenso werden zukünftige Vergleiche von Chemikalien, die Wachstumsstörungen fördern, wie Disopyramid, und weniger wirksamen Chemikalien wie Oryzalin oder Kumamotorsäure, Hinweise darauf liefern, wie Wachstumsstörungen entstehen.
Andererseits sind abwehrbedingte Zytoskelett-Umlagerungen eine weitere Möglichkeit, die Zytotoxizität von Ursonsäure zu erklären. Die Infektion mit einem Pathogen oder die Einführung eines Auslösers in Pflanzenzellen führt manchmal zur Zerstörung des Zytoskeletts und anschließend zum Zelltod29. Beispielsweise wurde berichtet, dass aus Oomyceten gewonnenes Cryptoxanthin Mikrotubuli und Aktinfilamente vor dem Zelltod von Tabakzellen zerstört, ähnlich wie dies bei einer KAND-Behandlung geschieht30,31. Die Ähnlichkeiten zwischen Abwehrreaktionen und zellulären Reaktionen durch Ursonsäure führten zu der Hypothese, dass sie gemeinsame zelluläre Prozesse auslösen, obwohl eine schnellere und stärkere Wirkung von Ursonsäure als von Cryptoxanthin erkennbar ist. Studien haben jedoch gezeigt, dass die Zerstörung von Aktinfilamenten den spontanen Zelltod fördert, der nicht immer mit einer Zerstörung der Mikrotubuli einhergeht29. Darüber hinaus bleibt abzuwarten, ob entweder der Pathogen oder der Auslöser ein gestörtes Wurzelwachstum verursacht, wie dies bei Ursonsäurederivaten der Fall ist. Daher ist die Erforschung der molekularen Zusammenhänge zwischen Abwehrreaktionen und dem Zytoskelett ein vielversprechendes Forschungsgebiet. Durch die Nutzung niedermolekularer Verbindungen, die mit der Ursonsäure verwandt sind, sowie einer Reihe von Derivaten mit unterschiedlicher Wirksamkeit könnten sie Möglichkeiten eröffnen, unbekannte zelluläre Mechanismen gezielt zu untersuchen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Entdeckung und Anwendung neuer Verbindungen, die die Mikrotubuli-Dynamik modulieren, leistungsstarke Methoden zur Erforschung der komplexen molekularen Mechanismen der Formbestimmung pflanzlicher Zellen liefern wird. In diesem Zusammenhang könnte die kürzlich entwickelte Verbindung Urmotonsäure, die Mikrotubuli und Aktinfilamente beeinflusst und Zelltod induziert, die Möglichkeit bieten, den Zusammenhang zwischen der Mikrotubuli-Kontrolle und diesen anderen Mechanismen zu entschlüsseln. Chemische und biologische Analysen mit Urbenonsäure werden uns somit helfen, die molekularen Regulationsmechanismen des pflanzlichen Zytoskeletts zu verstehen.
S. werraensis MK493-CF1 wird in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben mit Schikane eingeimpft. Dieser enthält 110 ml Saatmedium bestehend aus 2 % (w/v) Galaktose, 2 % (w/v) Essence Paste, 1 % (w/v) Bacto-Sojaton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5 % (w/v) Maisextrakt (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0,2 % (w/v) (NH4)2SO4 und 0,2 % CaCO3 in deionisiertem Wasser (pH 7,4 vor Sterilisation). Die Saatkulturen werden 2 Tage lang bei 27 °C auf einem Rotationsschüttler (180 U/min) inkubiert. Produktionsanbau erfolgt mittels Feststofffermentation. Die Impfkultur (7 ml) wurde in eine 500-ml-K-1-Flasche überführt. Diese enthielt 40 g Produktionsmedium, bestehend aus 15 g gepresster Gerste (MUSO Co., Ltd., Japan) und 25 g deionisiertem Wasser (pH-Wert vor der Sterilisation nicht angepasst). Die Fermentation erfolgte 14 Tage lang bei 30 °C im Dunkeln. Das Fermentationsmaterial wurde mit 40 ml/Flasche EtOH extrahiert und zentrifugiert (1500 g, 4 °C, 10 min). Der Kulturüberstand (60 ml) wurde mit einer 10%igen MeOH/EtOAc-Mischung extrahiert. Die organische Schicht wurde unter reduziertem Druck eingedampft, um einen Rückstand (59,5 mg) zu erhalten, der einer HPLC mit Gradientelution (0–10 Minuten: 90 %) auf einer Umkehrphasensäule (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × Länge 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 Minuten: 90 % H2O/CH3CN bis 70 % H2O/CH3CN (Gradient), 35–45 Minuten: 90 % H2O/EtOH, 45–155 Minuten: 90 % H2O/EtOH bis 100 % EtOH (Gradient, 155–200 min: 100 % EtOH) bei einer Flussrate von 1,5 ml/min unterzogen wurde. Cumamonamid (1, 36,0 mg) wurde als weißes amorphes Pulver isoliert.
Kumamotoamid(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t , J = 3,8 Hz, 1H). ), 4,08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ berechneter Wert: 141,0659, gemessener Wert: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Columbia-Samen (Col-0) wurden mit Genehmigung des Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) für Forschungszwecke bezogen. Col-0-Samen wurden unter unseren Laborbedingungen vermehrt und gepflegt und als Wildtyp-Arabidopsis-Pflanzen verwendet. Arabidopsis-Samen wurden oberflächensterilisiert und in halbkonzentriertem Murashige- und Skoog-Medium mit 2 % Saccharose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05 % (w/v) 2-(4-Morpholino)ethansulfonsäure (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) und 1,5 % Agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, bei 23 °C und Dauerlicht kultiviert. Samen des phs1-1-Mutanten wurden von T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) bereitgestellt.
Samen des Stammes SR-1 wurden von T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) bereitgestellt und als Wildtyp-Tabakpflanzen verwendet. Die Tabaksamen wurden oberflächensterilisiert und drei Nächte in sterilem Wasser eingeweicht, um die Keimung zu fördern. Anschließend wurden sie in eine halbkonzentrierte Lösung mit 2 % Saccharose, 0,05 % (w/v) MES und 0,8 % Gellangummi (Fujifilm Wako Pure Chemical, Murashige und Skoog-Medium) mit einem pH-Wert von 5,7 gegeben und bei 23 °C unter konstantem Licht inkubiert.
Der Stamm Tak-1 wurde von T. Kohchi (Universität Kyoto) bereitgestellt und diente als Standard-Versuchseinheit für die Lebermoos-Studie. Gemma wurde aus sterilisierten Kulturpflanzen gewonnen und anschließend auf Gamborg B5-Medium (Fujifilm Wako Pure Chemical) mit 1 % Saccharose und 0,3 % Gellangummi ausgesät und bei 23 °C unter Dauerlicht inkubiert.
Tabak-BY-2-Zellen (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) wurden von S. Hasezawa (Universität Tokio) zur Verfügung gestellt. BY-2-Zellen wurden 95-fach in modifiziertem Linsmeier- und Skoog-Medium verdünnt und wöchentlich mit 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure 32 ergänzt. Die Zellsuspension wurde auf einem Rotationsschüttler bei 27 °C im Dunkeln bei 130 UpM gemischt. Zellen mit dem 10-fachen Volumen an frischem Medium waschen und im gleichen Medium resuspendieren. BY-2-transgene Zelllinien, die den Mikrotubuli-Marker TagRFP-TUA6 oder den Aktinfilament-Marker GFP-ABD2 unter dem Blumenkohlmosaikvirus-35S-Promoter stabil exprimieren, wurden wie beschrieben erzeugt33,34,35. Diese Zelllinien können mit ähnlichen Verfahren wie die für die ursprüngliche BY-2-Zelllinie verwendeten erhalten und synchronisiert werden.
HeLa-Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) (Life Technologies), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 1,2 U/ml Penicillin und 1,2 μg/ml Streptomycin, in einem 37 °C warmen Inkubator mit 5 % CO2 kultiviert.
Alle in diesem Manuskript beschriebenen Experimente wurden in Übereinstimmung mit den japanischen Vorschriften und Richtlinien zur Biosicherheit durchgeführt.
Verbindungen wurden als Stammlösungen in Dimethylsulfoxid (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) gelöst und in MS-Medium für Arabidopsis und Tabak oder in Gamborg B5-Medium für Lebermoos verdünnt. Für den Test zur Hemmung des Wurzelwachstums wurden mehr als 10 Samen pro Platte auf Agarmedium mit den angegebenen Verbindungen oder DMSO ausgesät. Die Samen wurden 7 Tage in einer Wachstumskammer inkubiert. Die Setzlinge wurden fotografiert und die Länge der Wurzeln gemessen. Für den Arabidopsis-Keimungstest wurden 48 Samen pro Platte auf Agarmedium mit 200 μM Verbindung oder DMSO ausgesät. Arabidopsis-Samen wurden in einer Wachstumskammer gezüchtet und die Zahl der gekeimten Setzlinge 7 Tage nach der Keimung (dag) gezählt. Für den Tabak-Keimungstest wurden 24 Samen pro Platte auf Agarmedium mit 200 μM KAND oder DMSO ausgesät. Tabaksamen wurden in einer Wachstumskammer gezüchtet und die Anzahl der gekeimten Sämlinge nach 14 Tagen gezählt. Für den Lebermoos-Wachstumshemmungstest wurden neun Embryonen von jeder Platte auf Agarmedium mit den angegebenen Konzentrationen von KAND oder DMSO ausgesät und 14 Tage in einer Wachstumskammer inkubiert.
Verwenden Sie mit 5 mg/ml Propidiumiodid (PI) gefärbte Sämlinge, um die Organisation des Wurzelmeristems zu visualisieren. PI-Signale wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie mit einem konfokalen TCS SPE-Laser-Scanning-Mikroskop (Leica Microsystems) beobachtet.
Die histochemische Färbung der Wurzeln mit β-Glucuronidase (GUS) erfolgte nach dem von Malami und Benfey36 beschriebenen Protokoll. Die Sämlinge wurden über Nacht in 90%igem Aceton fixiert, 1 Stunde lang mit 0,5 mg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-d-glucuronsäure in GUS-Puffer gefärbt und in eine hydratisierte Chloraldehydlösung (8 g Chloralhydrat, 2 ml Wasser und 1 ml Glycerin) gegeben und mittels differentieller Interferenzkontrastmikroskopie unter Verwendung eines Axio Imager M1-Mikroskops (Carl Zeiss) beobachtet.
Die Wurzelwinkel wurden an 7 Tage alten Setzlingen gemessen, die auf vertikal aufgestellten Platten gewachsen waren. Messen Sie den Winkel der Wurzel zur Richtung des Schwerkraftvektors, wie in Schritt 6 beschrieben.
Die Anordnung der kortikalen Mikrotubuli wurde wie beschrieben mit geringfügigen Änderungen am Protokoll 37 beobachtet. Anti-β-Tubulin-Antikörper (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) und Alexa Fluor 488-konjugiertes Anti-Maus-IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) wurden als primäre und sekundäre Antikörper in Verdünnungen von 1:1000 bzw. 1:100 verwendet. Fluoreszenzbilder wurden mit einem konfokalen TCS SPE-Laser-Scanning-Mikroskop (Leica Microsystems) aufgenommen. Z-Stapel-Bilder und Maximalintensitätsprojektionen wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers aufgenommen.
Der HeLa-Zellproliferationstest wurde mit dem Cell Counting Kit 8 (Dojindo) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
Das Wachstum von E. coli DH5α wurde durch Messung der Zelldichte in der Kultur mit einem Spektrophotometer bei 600 nm (OD600) analysiert.
Die zytoskelettale Organisation in transgenen BY-2-Zellen wurde mit einem Fluoreszenzmikroskop, ausgestattet mit einem konfokalen CSU-X1-Scanner (Yokogawa) und einer sCMOS-Kamera (Zyla, Andor Technology), beobachtet. Die zytoskelettale Dichte wurde mittels Bildanalyse ermittelt, wobei der Anteil zytoskelettaler Pixel an den zytoplasmatischen Pixeln in konfokalen Bildern mit der Software ImageJ wie beschrieben quantifiziert wurde38,39.
Um Zelltod in BY-2-Zellen nachzuweisen, wurde ein Aliquot der Zellsuspension 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 0,05 % Evans-Blau inkubiert. Die selektive Evans-Blau-Färbung toter Zellen beruht auf der Extrusion des Farbstoffs aus lebenden Zellen durch die intakte Plasmamembran40. Die gefärbten Zellen wurden mit einem Hellfeldmikroskop (BX53, Olympus) beobachtet.
HeLa-Zellen wurden in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂ gezüchtet. Die Zellen wurden 6 Stunden lang bei 37 °C mit 100 μM KAND 11, Kumamonaminsäure 6, Kumamonamid 1, 100 ng/ml Colcemid (Gibco) oder 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) behandelt. Die Zellen wurden 10 Minuten lang mit MetOH und dann 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Acetat fixiert. Die fixierten Zellen wurden 2 Stunden lang mit dem primären β-Tubulin-Antikörper (1D4A4, Proteintech: 66240-1), verdünnt in 0,5 % BSA/PBS, inkubiert, dreimal mit TBST gewaschen und anschließend mit Alexa Fluor Ziegen-Antikörper inkubiert. 488 1 Stunde. – Maus-IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) und 15 ng/ml 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), verdünnt in 0,5 % BSA/PBS. Nach dreimaligem Waschen mit TBST wurden die gefärbten Zellen unter einem Nikon Eclipse Ti-E-Invertmikroskop untersucht. Die Bilder wurden mit einer gekühlten Hamamatsu ORCA-R2 CCD-Kamera unter Verwendung der MetaMorph-Software (Molecular Devices) aufgenommen.
Veröffentlichungszeit: 17. Juni 2024