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Die Entdeckung und der Nutzen von Naturprodukten können zur Verbesserung der menschlichen Lebensqualität beitragen. Pflanzenwachstumshemmende Chemikalien werden häufig als Herbizide zur Unkrautbekämpfung eingesetzt. Aufgrund des Bedarfs an verschiedenen Herbizidtypen besteht ein Bedarf an Verbindungen mit neuen Wirkmechanismen. In dieser Studie entdeckten wir aus Streptomyces werraensis MK493-CF1 eine neuartige N-Alkoxypyrrol-Verbindung, Coumamonamid, und etablierten die vollständige Synthese. Mithilfe von Bioaktivitätstests stellten wir fest, dass Urs-Monoaminsäure ein synthetisches Zwischenprodukt von Urs-Monoamid und ein potenzieller Wirkstoff ist.PflanzenwachstumshemmerDarüber hinaus haben wir verschiedene Urbenonsäurederivate entwickelt, darunter das Urbenyloxyderivat (UDA), das eine hohe herbizide Wirkung aufweist, ohne das Wachstum von HeLa-Zellen negativ zu beeinflussen. Wir fanden außerdem heraus, dass Urmotonsäurederivate pflanzliche Mikrotubuli stören; zusätzlich beeinflusst KAND Aktinfilamente und induziert Zelltod. Diese vielfältigen Effekte unterscheiden sich von denen bekannter Mikrotubuli-Inhibitoren und deuten auf einen neuen Wirkmechanismus der Ursonsäure hin, was einen wichtigen Vorteil für die Entwicklung neuer Herbizide darstellt.
Die Entdeckung und praktische Anwendung nützlicher Naturstoffe und ihrer Derivate ist ein Mittel zur Verbesserung der menschlichen Lebensqualität. Sekundärmetaboliten, die von Mikroorganismen, Pflanzen und Insekten produziert werden, haben zu bedeutenden Fortschritten in Medizin und Landwirtschaft geführt. Viele Antibiotika und Medikamente gegen Leukämie wurden aus Naturstoffen entwickelt. Darüber hinaus gibt es verschiedene Arten vonPestizideAus diesen Naturprodukten werden Fungizide und Herbizide für die Landwirtschaft gewonnen. Insbesondere Herbizide zur Unkrautbekämpfung sind wichtige Instrumente zur Steigerung der Ernteerträge in der modernen Landwirtschaft, und verschiedene Wirkstoffe werden bereits kommerziell eingesetzt. Mehrere zelluläre Prozesse in Pflanzen, wie Photosynthese, Aminosäurestoffwechsel, Zellwandsynthese, Mitoseregulation, Phytohormon-Signalisierung oder Proteinsynthese, gelten als typische Angriffspunkte von Herbiziden. Verbindungen, die die Mikrotubuli-Funktion hemmen, stellen eine häufige Herbizidklasse dar, die das Pflanzenwachstum durch Beeinflussung der Mitoseregulation beeinträchtigt.
Mikrotubuli sind Bestandteile des Zytoskeletts und in eukaryotischen Zellen weit verbreitet. Das Tubulin-Heterodimer besteht aus α-Tubulin und β-Tubulin, die lineare Mikrotubuli-Protofilamente bilden. 13 dieser Protofilamente bilden eine zylindrische Struktur. Mikrotubuli spielen in Pflanzenzellen vielfältige Rollen, unter anderem bei der Bestimmung der Zellform, der Zellteilung und des intrazellulären Transports3,4. Pflanzenzellen enthalten Mikrotubuli unterhalb der Interphasen-Plasmamembran. Diese sogenannten kortikalen Mikrotubuli steuern vermutlich die Organisation der Cellulose-Mikrofibrillen durch die Regulation von Cellulose-Synthase-Komplexen4,5. Die kortikalen Mikrotubuli der Wurzel-Epidermiszellen, die in der Zone des schnellen Längenwachstums der Wurzelspitze vorkommen, verlaufen lateral. Cellulose-Mikrofasern folgen diesen Mikrotubuli und begrenzen die Richtung des Zellwachstums, wodurch anisotropes Zellwachstum gefördert wird. Die Funktion der Mikrotubuli ist daher eng mit der Pflanzenmorphologie verknüpft. Aminosäuresubstitutionen in Genen, die für Tubulin kodieren, verursachen eine Fehlausrichtung der kortikalen Mikrotubuli-Anordnung und links- oder rechtsseitiges Wachstum in Arabidopsis 6,7. Mutationen in Mikrotubuli-assoziierten Proteinen, die die Mikrotubuli-Dynamik regulieren, können ebenfalls zu verzerrtem Wurzelwachstum führen8,9,10,11,12,13. Darüber hinaus verursacht die Behandlung mit Mikrotubuli-störenden Herbiziden wie Disopyramid (auch bekannt als Pretilachlor) ebenfalls linksseitiges, schräges Wurzelwachstum14. Diese Daten zeigen, dass die präzise Regulation der Mikrotubuli-Funktion entscheidend für die Bestimmung der Wachstumsrichtung von Pflanzen ist.
Es wurden verschiedene Arten von Mikrotubuli-Inhibitoren entdeckt, und diese Wirkstoffe haben wesentlich zur Zytoskelettforschung sowie zur Landwirtschaft und Medizin beigetragen². Insbesondere Oryzalin, Dinitroanilin-Verbindungen, Disopyramid, Benzamid-Derivate und deren Analoga können die Mikrotubuli-Funktion und damit das Pflanzenwachstum hemmen. Daher werden sie häufig als Herbizide eingesetzt. Da Mikrotubuli jedoch ein wichtiger Bestandteil von Pflanzen- und Tierzellen sind, wirken die meisten Mikrotubuli-Inhibitoren zytotoxisch auf beide Zelltypen. Trotz ihrer anerkannten Nützlichkeit als Herbizide wird daher nur eine begrenzte Anzahl von Mikrotubuli-Inhibitoren in der Praxis verwendet.
Streptomyces ist eine Gattung der Familie Streptomyces, zu der aerobe, grampositive, filamentöse Bakterien gehören und die für ihre Fähigkeit zur Produktion einer Vielzahl von Sekundärmetaboliten bekannt ist. Daher gilt sie als eine der wichtigsten Quellen neuer biologisch aktiver Naturstoffe. In der vorliegenden Studie entdeckten wir eine neue Verbindung namens Coumamonamid, die aus Streptomyces werraensis MK493-CF1 und S. werraensis ISP 5486 isoliert wurde. Mittels Spektralanalyse und vollständiger Spektralanalyse wurde die Struktur von Coumamonamid charakterisiert und sein einzigartiges N-Alkoxypyrrol-Gerüst bestimmt. Ursmonsäure, ein synthetisches Zwischenprodukt von Ursmonamid und seinen Derivaten, hemmt das Wachstum und die Keimung der Modellpflanze Arabidopsis thaliana. In einer Struktur-Wirkungsbeziehungsstudie fanden wir heraus, dass eine Verbindung mit an C9 modifizierter Ursonsäure, genannt Nonyloxy-Derivat der Ursonsäure (KAND), die hemmende Wirkung auf Wachstum und Keimung signifikant verstärkt. Bemerkenswerterweise beeinflusste der neu entdeckte Pflanzenwachstumshemmer auch das Wachstum von Tabak und Lebermoos und war nicht zytotoxisch für Bakterien oder HeLa-Zellen. Darüber hinaus induzieren einige Urmotonsäurederivate einen veränderten Wurzelphänotyp, was darauf hindeutet, dass diese Derivate direkt oder indirekt auf Mikrotubuli einwirken. Im Einklang mit dieser Annahme zeigen unsere Beobachtungen von Mikrotubuli, die entweder immunhistochemisch oder mit fluoreszierenden Proteinen markiert wurden, dass die Behandlung mit KAND Mikrotubuli depolymerisiert. Zusätzlich störte die Behandlung mit Kumamotonsäurederivaten Aktin-Mikrofilamente. Somit haben wir einen neuen Pflanzenwachstumshemmer entdeckt, dessen einzigartiger Wirkmechanismus die Zerstörung des Zytoskeletts beinhaltet.
Der Stamm MK493-CF1 wurde aus Bodenproben aus Shinagawa-ku, Tokio, isoliert. Er bildete ein gut verzweigtes Stromamyzel. Die partielle Sequenz des 16S ribosomalen RNA-Gens (1422 bp) wurde bestimmt. Dieser Stamm weist eine hohe Ähnlichkeit zu S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: typischer Stamm, 99,93 %) auf. Aufgrund dieses Ergebnisses wurde festgestellt, dass dieser Stamm eng mit dem Typstamm von S. werraensis verwandt ist. Daher wurde er vorläufig als S. werraensis MK493-CF1 bezeichnet. S. werraensis ISP 5486T produziert ebenfalls dieselben bioaktiven Verbindungen. Da die Gewinnung von Naturstoffen aus diesem Mikroorganismus bisher wenig erforscht war, wurden weitere chemische Untersuchungen durchgeführt. Nach der Kultivierung von S. werraensis MK493-CF1 auf Gerstenmedium durch Feststofffermentation bei 30 °C über 14 Tage wurde das Medium mit 50%igem Ethanol extrahiert. 60 ml der Probe wurden getrocknet, um 59,5 mg Rohextrakt zu erhalten. Der Rohextrakt wurde mittels Umkehrphasen-HPLC aufgetrennt, wodurch N-Methoxy-1H-pyrrol-2-carboxamid (1, genannt Kumamotoamid, 36,0 mg) isoliert wurde. Die Gesamtmenge an 1 beträgt ca. 60 % des Rohextrakts. Daher haben wir uns entschieden, die Eigenschaften von Kumamotoamid 1 genauer zu untersuchen.
Cumamonamid 1 ist ein weißes, amorphes Pulver. Die hochauflösende Massenspektrometrie (HRESIMS) bestätigt die Summenformel C6H8N2O2 (Abb. 1). Das C2-substituierte Pyrrolfragment dieser Verbindung ist charakterisiert durch folgende Signale: δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH im 1H-NMR-Spektrum: 4,5 Hz, H-5) und δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6). Das 13C-NMR-Spektrum zeigt das Vorhandensein von vier sp2-hybridisierten Kohlenstoffatomen. Das Vorliegen einer Amidgruppe in C2-Position wurde durch HMBC-Korrelation vom C-3-Proton zum Amid-Carbonylkohlenstoff bei δC 161,1 nachgewiesen. Zusätzlich deuten die 1H- und 13C-NMR-Signale bei δH 4,10 (3H, S) und δC 68,3 auf das Vorhandensein von N-Methoxygruppen im Molekül hin. Obwohl die genaue Position der Methoxygruppe mittels spektroskopischer Analysen wie der erweiterten Differenzspektroskopie und der nuklearen Overhauser-Abkürzung (NOEDF) noch nicht bestimmt worden war, wurde N-Methoxy-1H-pyrrol-2-carboxamid als erste Kandidatenverbindung in Betracht gezogen.
Zur Bestimmung der korrekten Struktur von 1 wurde eine Totalsynthese durchgeführt (Abb. 2a). Die Umsetzung des kommerziell erhältlichen 2-Aminopyridins 2 mit m-CPBA führte zum entsprechenden N-Oxid 3 in quantitativer Ausbeute. Nach der 2-Aminoazidierung von 2 wurde die von Abramovich beschriebene Cyclokondensationsreaktion in Benzol bei 90 °C durchgeführt, um das gewünschte 1-Hydroxy-1H-pyrrol-2-carbonitril 5 in 60 % Ausbeute (zwei Stufen) zu erhalten.15,16 Methylierung und Hydrolyse von 4 ergaben anschließend 1-Methoxy-1H-pyrrol-2-carbonsäure (im Folgenden „Cumotonsäure“, 6) in guter Ausbeute (70 %, zwei Stufen). Schließlich lieferte die Amidierung über das Säurechlorid-Zwischenprodukt 6 mit wässrigem Ammoniak das Kumamoto-Amid 1 in 98 % Ausbeute. Alle Spektraldaten des synthetisierten 1 waren mit denen des isolierten 1 vergleichbar, sodass die Struktur von 1 bestimmt werden konnte.
Allgemeine Synthese und Analyse der biologischen Aktivität von Urbenamid und Urbensäure. (a) Totalsynthese von Kumamoto-Amid. (b) Sieben Tage alte Wildtyp-Keimlinge der Ackerschmalwand (Arabidopsis Columbia (Col)) wurden auf Murashige- und Skoog-Agarplatten (MS) mit Coumamonamid 6 oder Coumamonamid 1 in den angegebenen Konzentrationen angezogen. Maßstab = 1 cm.
Zunächst untersuchten wir die biologischen Aktivitäten von Urbenamid und seinen Zwischenprodukten hinsichtlich ihrer Fähigkeit, das Pflanzenwachstum zu modulieren. Wir gaben verschiedene Konzentrationen von Ursmonamid 1 oder Ursmonsäure 6 zu MS-Agar-Medium und kultivierten Arabidopsis thaliana-Keimlinge auf diesem Medium. Diese Untersuchungen zeigten, dass hohe Konzentrationen (500 μM) von 6 das Wurzelwachstum hemmten (Abb. 2b). Anschließend erzeugten wir verschiedene Derivate durch Substitution an Position N1 von 6 und führten Struktur-Wirkungsbeziehungsstudien durch (die Synthese der Analoga ist in den Zusatzinformationen (SI) beschrieben). Arabidopsis-Keimlinge wurden auf einem Medium mit 50 μM Ursmonsäurederivaten angezogen, und die Wurzellänge wurde gemessen (siehe Abbildung). Wie in Abbildung 3a, b und S1 dargestellt, weisen Cumaminsäuren an Position N1 entweder lineare Alkoxyketten unterschiedlicher Länge (9, 10, 11, 12 und 13) oder lange Alkoxyketten (15, 16 und 17) auf. Die Derivate zeigten eine signifikante Hemmung des Wurzelwachstums. Darüber hinaus stellten wir fest, dass die Anwendung von 200 μM 10, 11 oder 17 die Keimung hemmte (Abb. 3c und S2).
Untersuchung der Struktur-Wirkungs-Beziehung von Kumamoto-Amid und verwandten Verbindungen. (a) Struktur und Syntheseschema von Analoga. (b) Quantifizierung der Wurzellänge von 7 Tage alten Sämlingen, die auf MS-Medium mit und ohne 50 μM Cumamonamid-Derivaten kultiviert wurden. Asterisken kennzeichnen signifikante Unterschiede zur Kontrollgruppe (t-Test, p < 0,05).< 0,05). n>18. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. „nt“ bedeutet „nicht getestet“, da mehr als 50 % der Samen nicht keimten. (c) Quantifizierung der Keimungsrate behandelter Samen nach 7-tägiger Inkubation in MS-Medium mit und ohne 200 μM Coumamonamid und verwandten Verbindungen. Asterisken kennzeichnen signifikante Unterschiede zur Kontrollgruppe (Chi-Quadrat-Test). n = 96.
Interessanterweise verringerte die Anlagerung von Alkylseitenketten mit mehr als 9 Kohlenstoffatomen die inhibitorische Aktivität, was darauf schließen lässt, dass Verbindungen, die mit Kumamotosäure verwandt sind, Seitenketten einer bestimmten Größe benötigen, um ihre biologische Aktivität zu entfalten.
Da die Struktur-Wirkungsbeziehungsanalyse zeigte, dass C9 zu Ursonsäure modifiziert wurde und das Nonyloxyderivat der Ursonsäure (im Folgenden KAND 11 genannt) der wirksamste Pflanzenwachstumshemmer war, führten wir eine detailliertere Charakterisierung von KAND 11 durch. Die Behandlung von Arabidopsis mit 50 μM KAND 11 verhinderte die Keimung nahezu vollständig, während niedrigere Konzentrationen (40, 30, 20 oder 10 μM) von KAND 11 das Wurzelwachstum dosisabhängig hemmten (Abb. 4a, b). Um zu prüfen, ob KAND 11 die Lebensfähigkeit des Wurzelmeristems beeinflusst, untersuchten wir mit Propidiumiodid (PI) gefärbte Wurzelmeristeme und maßen deren Fläche. Die Größe des Meristems von Sämlingen, die auf einem Medium mit 25 μM KAND-11 kultiviert wurden, betrug 151,1 ± 32,5 μm, während die Größe des Meristems von Sämlingen auf einem Kontrollmedium mit DMSO 264,7 ± 30,8 μm betrug (Abb. 4c, d). Dies deutet darauf hin, dass KAND-11 die Zellaktivität und die Ausbreitung im Wurzelmeristem wiederherstellt. Entsprechend reduzierte die Behandlung mit KAND-11 die Menge des Zellteilungsmarkers CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS im Wurzelmeristem (Abb. 4e)17. Diese Ergebnisse legen nahe, dass KAND-11 das Wurzelwachstum durch die Reduktion der Zellproliferationsaktivität hemmt.
Analyse der wachstumshemmenden Wirkung von Urbenonsäurederivaten (Urbenyloxyderivaten). (a) Sieben Tage alte Wildtyp-Col-Keimlinge, kultiviert auf MS-Agarplatten mit den angegebenen Konzentrationen von KAND 11. Maßstab = 1 cm. (b) Quantifizierung der Wurzellänge. Buchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede (Tukey-HSD-Test, p < 0,05).< 0,05). n>16. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. (c) Konfokale Mikroskopie von Propidiumiodid-gefärbten Wurzeln des Wildtyps Col, die auf MS-Platten mit oder ohne 25 µM KAND 11 kultiviert wurden. Weiße Klammern markieren das Wurzelmeristem. Maßstabsbalken = 100 µm. (d) Quantifizierung der Wurzelmeristemgröße (n = 10 bis 11). Statistische Unterschiede wurden mittels t-Test ermittelt (p < 0,05).< 0,05). Die Balken stellen die durchschnittliche Meristemgröße dar. (e) Differenzielle Interferenzkontrastmikroskopie (DIC) eines Wurzelmeristems mit dem CDKB2-Konstrukt; 1pro: CDKB2; 1-GUS-gefärbt und gefärbt an 5 Tage alten Sämlingen, die auf MS-Platten mit oder ohne 25 µM KAND-Assay gezogen wurden.
Die Phytotoxizität von KAND 11 wurde weiterhin an einer anderen zweikeimblättrigen Pflanze, Tabak (Nicotiana tabacum), und einem wichtigen Modellorganismus für Landpflanzen, dem Lebermoos (Marchantia polymorpha), untersucht. Wie bei Arabidopsis thaliana bildeten Tabak-SR-1-Keimlinge, die auf einem Medium mit 25 μM KAND 11 kultiviert wurden, kürzere Wurzeln aus (Abb. 5a). Darüber hinaus keimten 40 von 48 Samen auf Agarplatten mit 200 μM KAND 11, während alle 48 Samen auf dem unbehandelten Medium keimten. Dies deutet darauf hin, dass höhere KAND-Konzentrationen signifikant waren (p < 0,05).p < 0,05 (Chi-Quadrat-Test) hemmte die Keimung von Tabak (Abb. 5b). Darüber hinaus war die Konzentration von KAND 11, die das Bakterienwachstum in Lebermoos hemmte, vergleichbar mit der wirksamen Konzentration in Arabidopsis (Abb. 5c). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass KAND 11 das Wachstum verschiedener Pflanzen hemmen kann. Anschließend untersuchten wir die mögliche Zytotoxizität von Verbindungen der Bärenmonoamid-Familie in anderen Organismen, nämlich in menschlichen HeLa-Zellen und im Escherichia coli-Stamm DH5α als Vertreter höherer tierischer bzw. bakterieller Zellen. In einer Reihe von Zellproliferationstests beobachteten wir, dass Cumamonamid 1, Cumamonamidsäure 6 und KAND 11 das Wachstum von HeLa- oder E. coli-Zellen bei einer Konzentration von 100 μM nicht beeinflussten (Abb. 5d,e).
Wachstumshemmung durch KAND 11 in Nicht-Arabidopsis-Organismen. (a) Zwei Wochen alte Wildtyp-Tabaksämlinge (SR-1) wurden auf vertikal positionierten MS-Platten mit 25 μM KAND 11 kultiviert. (b) Zwei Wochen alte Wildtyp-Tabaksämlinge (SR-1) wurden auf horizontal positionierten MS-Platten mit 200 μM KAND 11 kultiviert. (c) Zwei Wochen alte Wildtyp-Lebermoosknospen (Tak-1) wurden auf Gamborg-B5-Platten mit den angegebenen KAND-11-Konzentrationen kultiviert. Rote Pfeile markieren Sporen, deren Wachstum innerhalb der zweiwöchigen Inkubationszeit eingestellt wurde. (d) Zellproliferationstest von HeLa-Zellen. Die Anzahl lebensfähiger Zellen wurde in festgelegten Zeitabständen mit einem Zellzählkit (Dojindo) bestimmt. Als Kontrolle wurden HeLa-Zellen mit 5 μg/ml Actinomycin D (Act D) behandelt, das die RNA-Polymerase-Transkription hemmt und zum Zelltod führt. Die Analysen wurden dreifach durchgeführt. (e) E. coli-Zellproliferationstest. Das Wachstum von E. coli wurde durch Messung der OD600 analysiert. Als Kontrolle wurden Zellen mit 50 μg/ml Ampicillin (Amp) behandelt, welches die bakterielle Zellwandsynthese hemmt. Die Analysen wurden dreifach durchgeführt.
Um den Wirkmechanismus der durch Uramid-verwandte Verbindungen verursachten Zytotoxizität aufzuklären, analysierten wir Urbensäurederivate mit moderater Hemmwirkung erneut (siehe Abbildung). Wie in Abb. 2b und 6a dargestellt, bildeten Sämlinge, die auf Agarplatten mit hohen Konzentrationen (200 μM) Urmotonsäure 6 kultiviert wurden, kürzere und nach links gekrümmte Wurzeln (θ = –23,7 ± 6,1°), während Sämlinge auf dem Kontrollmedium nahezu gerade Wurzeln ausbildeten (θ = –3,8 ± 7,1°). Dieses charakteristische schräge Wachstum ist bekanntermaßen auf eine Dysfunktion der kortikalen Mikrotubuli zurückzuführen14,18. Im Einklang mit diesem Befund induzierten die mikrotubuli-destabilisierenden Substanzen Disopyramid und Oryzalin unter unseren Wachstumsbedingungen eine ähnliche Wurzelneigung (Abb. 2b, 6a). Gleichzeitig testeten wir Urmotonsäurederivate und wählten einige davon aus, die in bestimmten Konzentrationen schräges Wurzelwachstum induzierten. Die Verbindungen 8, 9 und 15 veränderten die Richtung des Wurzelwachstums bei 75 µM, 50 µM bzw. 40 µM, was darauf hindeutet, dass diese Verbindungen Mikrotubuli effektiv destabilisieren können (Abb. 2b, 6a). Wir testeten auch das wirksamste Ursolsäurederivat, KAND 11, in einer niedrigeren Konzentration (15 µM) und stellten fest, dass die Anwendung von KAND 11 das Wurzelwachstum hemmte und die Wurzelrichtung ungleichmäßig war, obwohl die Wurzeln tendenziell nach links abfielen (Abb. C3). Da höhere Konzentrationen von Mikrotubuli-destabilisierenden Substanzen manchmal eher das Pflanzenwachstum hemmen als eine Wurzelneigung zu verursachen, untersuchten wir anschließend die Möglichkeit, dass KAND 11 Mikrotubuli beeinflusst, indem wir kortikale Mikrotubuli in Wurzelepidermiszellen beobachteten. Immunhistochemische Untersuchungen mit Anti-β-Tubulin-Antikörpern an Epidermiszellen von Keimlingswurzeln, die mit 25 μM KAND 11 behandelt wurden, zeigten das Verschwinden nahezu aller kortikalen Mikrotubuli in den Epidermiszellen der Streckungszone (Abb. 6b). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Kumamotonsäure und ihre Derivate direkt oder indirekt auf Mikrotubuli wirken und diese stören, und dass es sich bei diesen Verbindungen um neuartige Mikrotubuli-Inhibitoren handelt.
Ursonsäure und ihre Derivate verändern die kortikalen Mikrotubuli in Arabidopsis thaliana. (a) Der Wurzelneigungswinkel wurde in Gegenwart verschiedener Urmotonsäurederivate in den angegebenen Konzentrationen gemessen. Die Wirkung zweier bekannter Mikrotubuli-Inhibitoren, Disopyramid und Oryzalin, wurde ebenfalls analysiert. Die Abbildung im Inset zeigt den Standard zur Messung des Wurzelwachstumswinkels. Asteriske kennzeichnen signifikante Unterschiede zur Kontrollgruppe (t-Test, p < 0,05).< 0,05). n>19. Maßstabsbalken = 1 cm. (b) Kortikale Mikrotubuli in Epidermiszellen der Streckungszone. Mikrotubuli in Wildtyp-Arabidopsis-Col-Wurzeln, die auf MS-Platten mit oder ohne 25 μM KAND 11 kultiviert wurden, wurden mittels immunhistochemischer Färbung mit β-Tubulin-Primärantikörpern und Alexa-Fluor-konjugierten Sekundärantikörpern visualisiert. Maßstabsbalken = 10 µm. (c) Mitotische Struktur der Mikrotubuli im Wurzelmeristem. Die Mikrotubuli wurden mittels immunhistochemischer Färbung visualisiert. Mitotische Strukturen, einschließlich Prophasezonen, Spindeln und Phragmoplasten, wurden anhand konfokaler Bilder ausgezählt. Pfeile markieren mitotische Mikrotubuli-Strukturen. Asterisken kennzeichnen signifikante Unterschiede zur Kontrollgruppe (t-Test, p < 0,05).< 0,05). n>9. Maßstab = 50 µm.
Obwohl Ursa die Funktion von Mikrotubuli stören kann, unterscheidet sich sein Wirkmechanismus vermutlich von dem typischer Mikrotubuli-Depolymerisationsmittel. Beispielsweise induzieren höhere Konzentrationen von Mikrotubuli-Depolymerisationsmitteln wie Disopyramid und Oryzalin eine anisotrope Expansion von Epidermiszellen, während KAND 11 dies nicht tut. Darüber hinaus führte die gleichzeitige Anwendung von KAND 11 und Disopyramid zu einer kombinierten, durch Disopyramid induzierten Wurzelwachstumsreaktion, während gleichzeitig eine durch KAND 11 induzierte Wachstumshemmung beobachtet wurde (Abb. S4). Wir analysierten auch die Reaktion der hypersensitiven Disopyramid-1-1-Mutante (phs1-1) auf KAND 11. phs1-1 weist eine nicht-kanonische Punktmutation der Tubulinkinase auf und bildet bei Behandlung mit Disopyramid kürzere Wurzeln aus9,20. phs1-1-Mutantenkeimlinge, die auf einem KAND-11-haltigen Agar-Medium kultiviert wurden, zeigten ähnlich kurze Wurzeln wie jene, die auf Disopyramid kultiviert wurden (Abb. S5).
Darüber hinaus beobachteten wir mitotische Mikrotubuli-Strukturen wie Prophasezonen, Spindeln und Phragmoplasten im Wurzelmeristem von mit KAND 11 behandelten Sämlingen. In Übereinstimmung mit den Beobachtungen für CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS wurde eine signifikante Abnahme der Anzahl mitotischer Mikrotubuli beobachtet (Abb. .6c).
Um die Zytotoxizität von KAND 11 auf subzellulärer Ebene zu charakterisieren, behandelten wir Tabak-BY-2-Suspensionszellen mit KAND 11 und beobachteten deren Reaktion. Zunächst gaben wir KAND 11 zu BY-2-Zellen, die TagRFP-TUA6 exprimierten (ein Fluoreszenzmarker für Mikrotubuli), um den Effekt von KAND 11 auf kortikale Mikrotubuli zu untersuchen. Die Dichte der kortikalen Mikrotubuli wurde mittels Bildanalyse bestimmt, wobei der prozentuale Anteil der Zytoskelett-Pixel an den Zytoplasma-Pixeln quantifiziert wurde. Die Ergebnisse zeigten, dass die Dichte nach einstündiger Behandlung mit 50 μM bzw. 100 μM KAND 11 signifikant auf 0,94 ± 0,74 % bzw. 0,23 ± 0,28 % sank, während die Dichte der mit DMSO behandelten Zellen 1,61 ± 0,34 % betrug (Abb. 7a). Diese Ergebnisse stimmen mit der Beobachtung in Arabidopsis überein, dass die Behandlung mit KAND 11 die Depolymerisation kortikaler Mikrotubuli induziert (Abb. 6b). Wir untersuchten außerdem die BY-2-Zelllinie mit GFP-ABD-markierten Aktinfilamenten nach Behandlung mit der gleichen Konzentration von KAND 11 und stellten fest, dass die Behandlung mit KAND 11 die Aktinfilamente zerstörte. Die Behandlung mit 50 μM bzw. 100 μM KAND 11 über 1 h reduzierte die Aktinfilamentdichte signifikant auf 1,20 ± 0,62 % bzw. 0,61 ± 0,26 %, während die Dichte in DMSO-behandelten Zellen 1,69 ± 0,51 % betrug (Abb. 2b). Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu den Effekten von Propyzamid, das Aktinfilamente nicht beeinflusst, und Latrunculin B, einem Aktin-Depolymerisator, der Mikrotubuli nicht beeinflusst (Abb. S6 im Anhang). Darüber hinaus hatte die Behandlung mit Coumamonamid 1, Coumamonamidsäure 6 oder KAND 11 keinen Einfluss auf die Mikrotubuli in HeLa-Zellen (SI Abb. S7). Daher wird angenommen, dass sich der Wirkmechanismus von KAND 11 von dem bekannter Zytoskelett-Disruptoren unterscheidet. Unsere mikroskopische Beobachtung von mit KAND 11 behandelten BY-2-Zellen zeigte zudem, dass während der Behandlung Zelltod einsetzte. Der Anteil Evans-Blau-gefärbter toter Zellen stieg nach 30 Minuten Behandlung mit KAND 11 nicht signifikant an, während er nach 90 Minuten Behandlung mit 50 μM bzw. 100 μM KAND auf 43,7 % bzw. 80,1 % anstieg (Abb. 7c). Zusammenfassend deuten diese Daten darauf hin, dass das neuartige Ursolsäurederivat KAND 11 ein pflanzenspezifischer Zytoskelett-Inhibitor mit einem bisher unbekannten Wirkmechanismus ist.
KAND beeinflusst kortikale Mikrotubuli, Aktinfilamente und die Lebensfähigkeit von Tabak-BY-2-Zellen. (a) Visualisierung kortikaler Mikrotubuli in BY-2-Zellen in Gegenwart von TagRFP-TUA6. BY-2-Zellen, die mit KAND 11 (50 μM oder 100 μM) oder DMSO behandelt wurden, wurden mittels Konfokalmikroskopie untersucht. Die Dichte der kortikalen Mikrotubuli wurde anhand von Mikroskopaufnahmen von 25 unabhängigen Zellen berechnet. Buchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede (Tukey-HSD-Test, p < 0,05).(p < 0,05). Maßstabsbalken = 10 µm. (b) Kortikale Aktinfilamente in BY-2-Zellen, visualisiert in Gegenwart von GFP-ABD2. BY-2-Zellen, die mit KAND 11 (50 µM oder 100 µM) oder DMSO behandelt wurden, wurden mittels Konfokalmikroskopie untersucht. Die Dichte der kortikalen Aktinfilamente wurde anhand von Mikroskopaufnahmen von 25 unabhängigen Zellen berechnet. Buchstaben kennzeichnen signifikante Unterschiede (Tukey-HSD-Test, p < 0,05).< 0,05). Maßstabsbalken = 10 µm. (c) Beobachtung toter BY-2-Zellen mittels Evans-Blau-Färbung. BY-2-Zellen, die mit KAND 11 (50 µM oder 100 µM) oder DMSO behandelt wurden, wurden mittels Hellfeldmikroskopie untersucht. n = 3. Maßstabsbalken = 100 µm.
Die Entdeckung und Anwendung neuer Naturstoffe hat zu bedeutenden Fortschritten in verschiedenen Bereichen des menschlichen Lebens geführt, darunter Medizin und Landwirtschaft. Seit jeher wird geforscht, um nützliche Verbindungen aus natürlichen Ressourcen zu gewinnen. Insbesondere Actinomyceten sind als antiparasitäre Antibiotika gegen Nematoden bekannt, da sie verschiedene Sekundärmetaboliten wie Avermectin, die Leitstruktur von Ivermectin, und Bleomycin sowie dessen Derivate produzieren, die medizinisch als Antikrebsmittel eingesetzt werden21,22. Ebenso wurden aus Actinomyceten verschiedene herbizide Verbindungen entdeckt, von denen einige bereits kommerziell genutzt werden1,23. Daher gilt die Analyse von Actinomyceten-Metaboliten zur Isolierung von Naturstoffen mit gewünschten biologischen Aktivitäten als effektive Strategie. In dieser Studie entdeckten wir aus S. werraensis eine neue Verbindung, Coumamonamid, und synthetisierten sie erfolgreich. Ursonsäure ist ein synthetisches Zwischenprodukt von Urbenamid und seinen Derivaten. Es kann zu charakteristischer Wurzelkrümmung führen, eine mäßige bis starke herbizide Wirkung zeigen und pflanzliche Mikrotubuli direkt oder indirekt schädigen. Der Wirkmechanismus der Urmotonsäure unterscheidet sich jedoch möglicherweise von dem bestehender Mikrotubuli-Inhibitoren, da KAND 11 auch Aktinfilamente stört und Zelltod verursacht, was auf einen regulatorischen Mechanismus hindeutet, durch den Urmotonsäure und ihre Derivate eine Vielzahl von Zytoskelettstrukturen beeinflussen.
Eine detailliertere Charakterisierung der Urbenonsäure wird zu einem besseren Verständnis ihres Wirkmechanismus beitragen. Insbesondere soll die Bindungsfähigkeit der Urbenonsäure an reduzierte Mikrotubuli untersucht werden, um festzustellen, ob Urbenonsäure und ihre Derivate direkt auf Mikrotubuli wirken und diese depolymerisieren oder ob ihre Wirkung zu deren Destabilisierung führt. Sollten Mikrotubuli kein direktes Ziel darstellen, trägt die Identifizierung des Wirkortes und der molekularen Zielstrukturen der Urbenonsäure in Pflanzenzellen zu einem besseren Verständnis der Eigenschaften verwandter Verbindungen und möglicher Wege zur Verbesserung ihrer herbiziden Wirkung bei. Unser Bioaktivitätstest zeigte die einzigartige zytotoxische Wirkung der Urbenonsäure auf das Wachstum von Pflanzen wie Arabidopsis thaliana, Tabak und Lebermoos, während E. coli- und HeLa-Zellen nicht beeinträchtigt wurden. Die geringe oder fehlende Toxizität gegenüber tierischen Zellen ist ein Vorteil von Urbenonsäurederivaten, falls diese als Herbizide für den Einsatz auf landwirtschaftlichen Flächen entwickelt werden sollen. Da Mikrotubuli in Eukaryoten weit verbreitet sind, ist ihre selektive Hemmung in Pflanzen eine wichtige Voraussetzung für Herbizide. Propyzamid, ein Mikrotubuli-Depolymerisationsmittel, das direkt an Tubulin bindet und dessen Polymerisation hemmt, wird beispielsweise aufgrund seiner geringen Toxizität gegenüber tierischen Zellen als Herbizid eingesetzt24. Im Gegensatz zu Disopyramid weisen verwandte Benzamide unterschiedliche Zielspezifitäten auf. Neben pflanzlichen Mikrotubuli hemmen RH-4032 bzw. Benzoxamid auch Mikrotubuli von tierischen Zellen bzw. Oomyceten, und Zalilamid wird aufgrund seiner geringen Phytotoxizität als Fungizid verwendet25,26,27. Das neu entdeckte Benzamid und seine Derivate zeigen selektive Zytotoxizität gegenüber Pflanzen. Es ist jedoch anzumerken, dass weitere Modifikationen ihre Zielspezifität verändern und potenziell zusätzliche Derivate zur Bekämpfung pathogener Pilze oder Oomyceten liefern könnten.
Die einzigartigen Eigenschaften der Urbenonsäure und ihrer Derivate sind nützlich für ihre Entwicklung als Herbizide und ihren Einsatz in der Forschung. Die Bedeutung des Zytoskeletts für die Kontrolle der Pflanzenzellform ist allgemein anerkannt. Frühere Studien haben gezeigt, dass Pflanzen komplexe Mechanismen zur Organisation kortikaler Mikrotubuli entwickelt haben, indem sie die Mikrotubulidynamik steuern, um die Morphogenese präzise zu regulieren. Zahlreiche Moleküle, die für die Regulation der Mikrotubuliaktivität verantwortlich sind, wurden identifiziert, und die Forschung in diesem Bereich ist noch nicht abgeschlossen3,4,28. Unser aktuelles Verständnis der Mikrotubulidynamik in Pflanzenzellen erklärt die Mechanismen der Organisation kortikaler Mikrotubuli noch nicht vollständig. Beispielsweise können sowohl Disopyramid als auch Oryzalin Mikrotubuli depolymerisieren, Disopyramid verursacht jedoch starke Wurzelverformungen, während Oryzalin eine relativ milde Wirkung hat. Mutationen im Tubulin, das Mikrotubuli stabilisiert, führen ebenfalls zu einer Rechtsdrehung der Wurzeln, während Paclitaxel, das ebenfalls die Mikrotubulidynamik stabilisiert, dies nicht tut. Die Untersuchung und Identifizierung der molekularen Zielstrukturen der Ursolsäure dürfte daher neue Erkenntnisse über die Regulation der kortikalen Mikrotubuli in Pflanzen liefern. Ebenso werden zukünftige Vergleiche von Substanzen, die Wachstumsstörungen effektiv fördern (z. B. Disopyramid), und weniger wirksamen Substanzen (z. B. Oryzalin oder Kumamotorsäure) Aufschluss darüber geben, wie diese Wachstumsstörungen entstehen.
Andererseits stellen abwehrbedingte Umstrukturierungen des Zytoskeletts eine weitere mögliche Erklärung für die Zytotoxizität von Ursonsäure dar. Die Infektion mit einem Pathogen oder die Einbringung eines Elicitors in Pflanzenzellen führt mitunter zur Zerstörung des Zytoskeletts und dem anschließenden Zelltod29. So wurde beispielsweise berichtet, dass aus Oomyceten gewonnenes Cryptoxanthin Mikrotubuli und Aktinfilamente vor dem Zelltod von Tabakzellen stört, ähnlich wie bei einer KAND-Behandlung30,31. Die Ähnlichkeiten zwischen Abwehrreaktionen und den durch Ursonsäure induzierten zellulären Reaktionen führten zu der Hypothese, dass sie gemeinsame zelluläre Prozesse auslösen, obwohl Ursonsäure eine schnellere und stärkere Wirkung als Cryptoxanthin zeigt. Studien haben jedoch gezeigt, dass die Störung von Aktinfilamenten den spontanen Zelltod fördert, der nicht immer mit einer Störung der Mikrotubuli einhergeht29. Darüber hinaus ist noch unklar, ob Pathogene oder Elicitoren, wie Ursonsäurederivate, zu gestörtem Wurzelwachstum führen. Die Erforschung der molekularen Zusammenhänge zwischen Abwehrreaktionen und dem Zytoskelett stellt daher ein attraktives Forschungsfeld dar. Durch die Nutzung von niedermolekularen Verbindungen, die mit Ursonsäure verwandt sind, sowie einer Reihe von Derivaten mit unterschiedlicher Wirkstärke könnten sich Möglichkeiten ergeben, unbekannte zelluläre Mechanismen gezielt zu untersuchen.
Zusammengenommen werden die Entdeckung und Anwendung neuer Verbindungen, die die Mikrotubuli-Dynamik modulieren, leistungsstarke Methoden zur Aufklärung der komplexen molekularen Mechanismen der pflanzlichen Zellformbestimmung liefern. In diesem Zusammenhang bietet die kürzlich entwickelte Verbindung Urmotonsäure, die Mikrotubuli und Aktinfilamente beeinflusst und Zelltod induziert, möglicherweise die Möglichkeit, den Zusammenhang zwischen der Mikrotubuli-Regulation und diesen anderen Mechanismen zu entschlüsseln. Chemische und biologische Analysen mit Urbenonsäure werden uns somit helfen, die molekularen Regulationsmechanismen des pflanzlichen Zytoskeletts zu verstehen.
S. werraensis MK493-CF1 wird in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen, der 110 ml Anzuchtmedium enthält, beimpft. Dieses Medium besteht aus 2 % (w/v) Galactose, 2 % (w/v) Essence Paste, 1 % (w/v) Bacto Composition -Soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5 % (w/v) Maisextrakt (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0,2 % (w/v) (NH₄)₂SO₄ und 0,2 % CaCO₃ in deionisiertem Wasser (pH 7,4 vor der Sterilisation). Die Anzuchtkulturen werden 2 Tage lang bei 27 °C auf einem Rotationsschüttler (180 U/min) inkubiert. Die Weiterverarbeitung erfolgt durch Feststofffermentation. Die Vorkultur (7 ml) wurde in einen 500-ml-K-1-Kolben überführt, der 40 g Produktionsmedium enthielt. Dieses bestand aus 15 g gepresster Gerste (MUSO Co., Ltd., Japan) und 25 g deionisiertem Wasser (pH-Wert vor der Sterilisation nicht eingestellt). Die Fermentation erfolgte 14 Tage lang bei 30 °C im Dunkeln. Das Fermentationsmaterial wurde mit 40 ml Ethanol pro Flasche extrahiert und zentrifugiert (1500 g, 4 °C, 10 min). Der Kulturüberstand (60 ml) wurde mit einem Gemisch aus 10 % Methanol und Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde unter reduziertem Druck eingedampft, um einen Rückstand (59,5 mg) zu erhalten, der mittels HPLC mit Gradientenelution (0–10 Minuten: 90 %) an einer Umkehrphasensäule (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × Länge 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 Minuten: 90 % H2O/CH3CN bis 70 % H2O/CH3CN (Gradient), 35–45 Minuten: 90 % H2O/EtOH, 45–155 Minuten: 90 % H2O/EtOH bis 100 % EtOH (Gradient), 155–200 Minuten: 100 % EtOH) bei einer Flussrate von 1,5 ml/min aufgetrennt wurde. Cumamonamid (1, 36,0 mg) wurde als weißes, amorphes Pulver isoliert.
Kumamotoamid(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz, 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H), 4,08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ berechneter Wert: 141,0659, gemessener Wert: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Samen der Sorte Columbia (Col-0) wurden mit Genehmigung des Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) für Forschungszwecke bezogen. Die Col-0-Samen wurden unter unseren Laborbedingungen vermehrt und als Wildtyp-Arabidopsis-Pflanzen verwendet. Die Arabidopsis-Samen wurden oberflächensterilisiert und in halbstarkem Murashige- und Skoog-Medium mit 2 % Saccharose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05 % (w/v) 2-(4-Morpholino)ethansulfonsäure (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) und 1,5 % Agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, bei 23 °C und Dauerlicht kultiviert. Samen der phs1-1-Mutante wurden von T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) zur Verfügung gestellt.
Samen des Stammes SR-1 wurden von T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) zur Verfügung gestellt und als Wildtyp-Tabakpflanzen verwendet. Die Tabaksamen wurden oberflächensterilisiert und drei Nächte lang in sterilem Wasser eingeweicht, um die Keimung zu fördern. Anschließend wurden sie in eine halbkonzentrierte Lösung mit 2 % Saccharose, 0,05 % (w/v) MES und 0,8 % Gellangummi (Fujifilm Wako Pure Chemical) auf Murashige- und Skoog-Medium mit pH 5,7 gegeben und bei 23 °C unter Dauerlicht inkubiert.
Der Stamm Tak-1 wurde von T. Kohchi (Universität Kyoto) zur Verfügung gestellt und diente als Standard-Versuchseinheit für die Lebermoosstudie. Gemma wurde aus sterilisierten Kulturpflanzen gewonnen und anschließend auf Gamborg-B5-Medium (Fujifilm Wako Pure Chemical) mit 1 % Saccharose und 0,3 % Gellangummi ausplattiert und bei 23 °C unter Dauerlicht inkubiert.
Tabak-BY-2-Zellen (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) wurden von S. Hasezawa (Universität Tokio) zur Verfügung gestellt. Die BY-2-Zellen wurden 95-fach in modifiziertem Linsmeier- und Skoog-Medium verdünnt und wöchentlich mit 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-DPA) versetzt. Die Zellsuspension wurde bei 27 °C im Dunkeln und 130 U/min auf einem Rotationsschüttler inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit dem 10-fachen Volumen an frischem Medium gewaschen und im gleichen Medium resuspendiert. Transgene BY-2-Zelllinien, die den Mikrotubuli-Marker TagRFP-TUA6 oder den Aktinfilament-Marker GFP-ABD2 unter dem 35S-Promotor des Blumenkohlmosaikvirus stabil exprimieren, wurden wie beschrieben generiert. Diese Zelllinien können mit ähnlichen Verfahren wie die ursprüngliche BY-2-Zelllinie kultiviert und synchronisiert werden.
HeLa-Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) (Life Technologies) kultiviert, das mit 10 % fötalem Kälberserum, 1,2 U/ml Penicillin und 1,2 μg/ml Streptomycin ergänzt war. Die Kultivierung erfolgte in einem 37 °C-Inkubator mit 5 % CO2.
Alle in diesem Manuskript beschriebenen Experimente wurden in Übereinstimmung mit den japanischen Biosicherheitsvorschriften und -richtlinien durchgeführt.
Die Substanzen wurden als Stammlösungen in Dimethylsulfoxid (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) gelöst und in MS-Medium für Arabidopsis und Tabak bzw. in Gamborg-B5-Medium für Lebermoos verdünnt. Für den Wurzelwachstumshemmungstest wurden mehr als 10 Samen pro Petrischale auf Agar-Medium mit den angegebenen Substanzen oder DMSO ausgesät. Die Samen wurden 7 Tage lang in einer Klimakammer inkubiert. Die Keimlinge wurden fotografiert und die Wurzellänge gemessen. Für den Keimungstest mit Arabidopsis wurden 48 Samen pro Petrischale auf Agar-Medium mit 200 μM der jeweiligen Substanz oder DMSO ausgesät. Die Arabidopsis-Samen wurden in einer Klimakammer kultiviert und die Anzahl der gekeimten Keimlinge 7 Tage nach der Keimung (dag) gezählt. Für den Keimungstest mit Tabak wurden 24 Samen pro Petrischale auf Agar-Medium mit 200 μM KAND oder DMSO ausgesät. Tabaksamen wurden in einer Klimakammer angezogen und die Anzahl der gekeimten Sämlinge nach 14 Tagen gezählt. Für den Lebermoos-Wachstumshemmungstest wurden jeweils 9 Embryonen von jeder Petrischale auf Agar-Nährboden mit den angegebenen Konzentrationen von KAND oder DMSO ausplattiert und 14 Tage lang in einer Klimakammer inkubiert.
Zur Visualisierung der Wurzelmeristemorganisation wurden Sämlinge verwendet, die mit 5 mg/ml Propidiumiodid (PI) gefärbt wurden. Die PI-Signale wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie mit einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop TCS SPE (Leica Microsystems) beobachtet.
Die histochemische Färbung der Wurzeln mit β-Glucuronidase (GUS) erfolgte nach dem von Malami und Benfey36 beschriebenen Protokoll. Die Sämlinge wurden über Nacht in 90%igem Aceton fixiert, anschließend eine Stunde lang mit 0,5 mg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronsäure in GUS-Puffer gefärbt und in eine Chloraldehyd-Hydratlösung (8 g Chloralhydrat, 2 ml Wasser und 1 ml Glycerin) überführt. Die Untersuchung erfolgte mittels Differenzialinterferenzkontrastmikroskopie mit einem Axio Imager M1 Mikroskop (Carl Zeiss).
Die Wurzelwinkel wurden an 7 Tage alten Sämlingen gemessen, die auf vertikal aufgestellten Petrischalen gezogen wurden. Messen Sie den Winkel der Wurzel zur Richtung des Schwerkraftvektors, wie in Schritt 6 beschrieben.
Die Anordnung der kortikalen Mikrotubuli wurde wie beschrieben beobachtet, mit geringfügigen Modifikationen des Protokolls37. Anti-β-Tubulin-Antikörper (KMX-1, Merck Millipore: MAB3408) und Alexa Fluor 488-konjugiertes Anti-Maus-IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) wurden als primäre bzw. sekundäre Antikörper in Verdünnungen von 1:1000 bzw. 1:100 verwendet. Fluoreszenzbilder wurden mit einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop TCS SPE (Leica Microsystems) aufgenommen. Z-Stapel-Bilder wurden aufgenommen und Maximum-Intensitäts-Projektionen gemäß den Herstellerangaben erstellt.
Der HeLa-Zellproliferationstest wurde mit dem Cell Counting Kit 8 (Dojindo) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
Das Wachstum von E. coli DH5α wurde durch Messung der Zelldichte in der Kultur mit einem Spektralphotometer bei 600 nm (OD600) analysiert.
Die Zytoskelettorganisation in transgenen BY-2-Zellen wurde mithilfe eines Fluoreszenzmikroskops mit konfokaler CSU-X1-Kamera (Yokogawa) und sCMOS-Kamera (Zyla, Andor Technology) untersucht. Die Zytoskelettdichte wurde mittels Bildanalyse bestimmt, wobei der prozentuale Anteil der Zytoskelett-Pixel an den Zytoplasma-Pixeln in den konfokalen Bildern mit der Software ImageJ quantifiziert wurde (siehe Referenzen 38 und 39).
Zum Nachweis von Zelltod in BY-2-Zellen wurde ein Aliquot der Zellsuspension 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 0,05 % Evans-Blau inkubiert. Die selektive Evans-Blau-Färbung toter Zellen beruht auf der Extrusion des Farbstoffs aus vitalen Zellen durch die intakte Plasmamembran40. Die gefärbten Zellen wurden mit einem Hellfeldmikroskop (BX53, Olympus) untersucht.
HeLa-Zellen wurden in DMEM mit 10 % FBS in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂ kultiviert. Die Zellen wurden 6 h bei 37 °C mit 100 μM KAND 11, Kumamonaminsäure 6, Kumamonamid 1, 100 ng/ml Colcemid (Gibco) oder 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) behandelt. Anschließend wurden die Zellen 10 min mit Methanol und danach 5 min mit Acetat bei Raumtemperatur fixiert. Die fixierten Zellen wurden 2 h mit einem in 0,5 % BSA/PBS verdünnten β-Tubulin-Primärantikörper (1D4A4, Proteintech: 66240-1) inkubiert, dreimal mit TBST gewaschen und anschließend 1 h mit einem Alexa Fluor-markierten Ziegenantikörper inkubiert. – Maus-IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) und 15 ng/ml 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), verdünnt in 0,5 % BSA/PBS. Nach dreimaligem Waschen mit TBST wurden die gefärbten Zellen mit einem inversen Mikroskop Nikon Eclipse Ti-E untersucht. Die Bilder wurden mit einer gekühlten Hamamatsu ORCA-R2 CCD-Kamera und der Software MetaMorph (Molecular Devices) aufgenommen.
Veröffentlichungsdatum: 17. Juni 2024