Vielen Dank für Ihren Besuch auf Nature.com. Die von Ihnen verwendete Browserversion unterstützt nur eingeschränkt CSS. Für optimale Ergebnisse empfehlen wir Ihnen, eine neuere Browserversion zu verwenden (oder den Kompatibilitätsmodus im Internet Explorer zu deaktivieren). Um die fortlaufende Unterstützung zu gewährleisten, zeigen wir die Website in der Zwischenzeit ohne Styling und JavaScript an.
Die Entdeckung und der sinnvolle Einsatz von Naturprodukten können das Leben der Menschen verbessern. Pflanzenwachstumshemmende Chemikalien werden häufig als Herbizide zur Unkrautbekämpfung eingesetzt. Aufgrund der Notwendigkeit, verschiedene Herbizidtypen einzusetzen, besteht Bedarf an Verbindungen mit neuen Wirkmechanismen. In dieser Studie entdeckten wir eine neue N-Alkoxypyrrol-Verbindung, Cumamonamid, aus Streptomyces werraensis MK493-CF1 und etablierten den vollständigen Syntheseprozess. Durch biologische Aktivitätstests entdeckten wir, dass Urs-Monoaminsäure ein synthetisches Zwischenprodukt von Urs-Monoamid und ein potenziellesPflanzenwachstumshemmer. Darüber hinaus haben wir verschiedene Urbenonsäure-Derivate entwickelt, darunter das Urbenyloxy-Derivat (UDA), das eine hohe herbizide Aktivität aufweist, ohne das Wachstum von HeLa-Zellen negativ zu beeinflussen. Wir fanden außerdem heraus, dass Urmotonsäure-Derivate die Mikrotubuli von Pflanzen zerstören; außerdem beeinflusst KAND Aktinfilamente und induziert Zelltod; Diese vielfältigen Effekte unterscheiden sich von denen bekannter Mikrotubuli-Inhibitoren und legen einen neuen Wirkmechanismus der Ursonsäure nahe, der einen wichtigen Vorteil bei der Entwicklung neuer Herbizide darstellt.
Die Entdeckung und praktische Anwendung nützlicher Naturprodukte und ihrer Derivate trägt zur Verbesserung der Lebensqualität bei. Sekundärmetaboliten von Mikroorganismen, Pflanzen und Insekten haben zu bedeutenden Fortschritten in Medizin und Landwirtschaft geführt. Viele Antibiotika und Leukämiemedikamente wurden aus Naturprodukten entwickelt. Darüber hinaus gibt es verschiedene Arten vonPestizideAus diesen Naturprodukten werden Fungizide und Herbizide für die Landwirtschaft gewonnen. Insbesondere Herbizide zur Unkrautbekämpfung sind wichtige Mittel zur Steigerung der Ernteerträge in der modernen Landwirtschaft, und verschiedene Arten von Verbindungen werden bereits kommerziell eingesetzt. Verschiedene zelluläre Prozesse in Pflanzen, wie Photosynthese, Aminosäurestoffwechsel, Zellwandsynthese, Regulierung der Mitose, Phytohormon-Signalgebung oder Proteinsynthese, gelten als typische Angriffspunkte von Herbiziden. Verbindungen, die die Mikrotubuli-Funktion hemmen, sind eine gängige Klasse von Herbiziden, die das Pflanzenwachstum durch Beeinflussung der mitotischen Regulation beeinträchtigen2.
Mikrotubuli sind Bestandteile des Zytoskeletts und in eukaryotischen Zellen weitgehend konserviert. Das Tubulin-Heterodimer besteht aus α-Tubulin und β-Tubulin, die lineare Mikrotubuli-Protofilamente bilden, wobei 13 Protofilamente eine zylindrische Struktur bilden. Mikrotubuli spielen in Pflanzenzellen mehrere Rollen, unter anderem bestimmen sie die Zellform, die Zellteilung und den intrazellulären Transport3,4. Pflanzenzellen enthalten Mikrotubuli unterhalb der Interphasenplasmamembran, und diese sogenannten kortikalen Mikrotubuli steuern vermutlich die Organisation von Cellulose-Mikrofibrillen durch die Regulierung von Cellulose-Synthase-Komplexen4,5. Kortikale Mikrotubuli von Wurzelepidermiszellen, die in der Zone schneller Verlängerung der Wurzelspitze vorhanden sind, liegen seitlich, und Cellulose-Mikrofasern folgen diesen Mikrotubuli und begrenzen die Richtung der Zellexpansion, wodurch sie eine anisotrope Zellverlängerung fördern. Deshalb ist die Funktion der Mikrotubuli eng mit der Pflanzenmorphologie verbunden. Aminosäuresubstitutionen in Tubulin-kodierenden Genen verursachen eine Schiefstellung der kortikalen Mikrotubuli-Anordnung und links- oder rechtsseitiges Wachstum bei Arabidopsis 6,7. Ebenso können Mutationen in Mikrotubuli-assoziierten Proteinen, die die Mikrotubuli-Dynamik regulieren, zu gestörtem Wurzelwachstum führen8,9,10,11,12,13. Auch die Behandlung mit Mikrotubuli-schädigenden Herbiziden wie Disopyramid, auch bekannt als Pretilachlor, führt zu linksseitigem schrägem Wurzelwachstum14. Diese Daten zeigen, dass die präzise Regulierung der Mikrotubuli-Funktion entscheidend für die Richtung des Pflanzenwachstums ist.
Es wurden verschiedene Arten von Mikrotubuli-Inhibitoren entdeckt, die wichtige Beiträge zur Zytoskelettforschung sowie zur Landwirtschaft und Medizin geleistet haben.2 Insbesondere Oryzalin, Dinitroanilinverbindungen, Disopyramid, Benzamid-verwandte Verbindungen und deren Analoga können die Mikrotubuli-Funktion und damit das Pflanzenwachstum hemmen. Daher werden sie häufig als Herbizide eingesetzt. Da Mikrotubuli jedoch ein wichtiger Bestandteil pflanzlicher und tierischer Zellen sind, wirken die meisten Mikrotubuli-Inhibitoren für beide Zelltypen zytotoxisch. Daher wird trotz ihres anerkannten Nutzens als Herbizide nur eine begrenzte Anzahl von Mikrotubuli-Inhibitoren in der Praxis eingesetzt.
Streptomyces ist eine Gattung der Familie Streptomyces, die aerobe, grampositive, filamentöse Bakterien umfasst und weithin für ihre Fähigkeit bekannt ist, ein breites Spektrum an Sekundärmetaboliten zu produzieren. Daher gilt sie als eine der wichtigsten Quellen für neue biologisch aktive Naturprodukte. In der vorliegenden Studie haben wir eine neue Verbindung namens Coumamonamid entdeckt, die aus Streptomyces werraensis MK493-CF1 und S. werraensis ISP 5486 isoliert wurde. Mittels Spektralanalyse und Vollspektralanalyse wurde die Struktur von Coumamonamid charakterisiert und sein einzigartiges N-Alkoxypyrrol-Gerüst bestimmt. Synthese. Es wurde festgestellt, dass Ursmonsäure, ein synthetisches Zwischenprodukt von Ursmonoamid und seinen Derivaten, das Wachstum und die Keimung der beliebten Modellpflanze Arabidopsis thaliana hemmt. In einer Studie zur Struktur-Wirkungs-Beziehung haben wir festgestellt, dass eine Verbindung mit zu Ursonsäure modifiziertem C9, das sogenannte Nonyloxy-Derivat der Ursonsäure (KAND), die hemmende Wirkung auf Wachstum und Keimung deutlich verstärkt. Bemerkenswerterweise beeinflusste der neu entdeckte Pflanzenwachstumshemmer auch das Wachstum von Tabak und Lebermoos und war weder für Bakterien noch für HeLa-Zellen zytotoxisch. Darüber hinaus induzieren einige Urmotonsäure-Derivate einen verzerrten Wurzelphänotyp, was darauf hindeutet, dass diese Derivate direkt oder indirekt Mikrotubuli beeinflussen. In Übereinstimmung mit dieser Idee deuten unsere Beobachtungen von Mikrotubuli, die entweder immunhistochemisch oder mit fluoreszierenden Proteinen markiert wurden, darauf hin, dass die KAND-Behandlung Mikrotubuli depolymerisiert. Darüber hinaus zerstörte die Behandlung mit Kumamotonsäure-Derivaten Aktin-Mikrofilamente. Somit haben wir einen neuen Pflanzenwachstumshemmer entdeckt, dessen einzigartiger Wirkmechanismus die Zerstörung des Zytoskeletts beinhaltet.
Stamm MK493-CF1 wurde aus Erde in Shinagawa-ku, Tokio, isoliert. Stamm MK493-CF1 bildete gut verzweigtes Stromamyzel. Die Teilsequenz des 16S-ribosomalen RNA-Gens (1422 bp) wurde bestimmt. Dieser Stamm ist S. werraensis sehr ähnlich (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: typischer Stamm, 99,93 %). Basierend auf diesem Ergebnis wurde festgestellt, dass dieser Stamm eng mit dem Typstamm von S. werraensis verwandt ist. Daher haben wir diesen Stamm vorläufig S. werraensis MK493-CF1 genannt. S. werraensis ISP 5486T produziert auch dieselben bioaktiven Verbindungen. Da es anfänglich kaum Forschung zur Gewinnung von Naturstoffen aus diesem Mikroorganismus gab, wurden weitere chemische Untersuchungen durchgeführt. Nach der Kultivierung von S. werraensis MK493-CF1 auf Gerstenmedium durch Feststofffermentation bei 30 °C für 14 Tage wurde das Medium mit 50 % EtOH extrahiert. 60 ml der Probe wurden getrocknet, um 59,5 mg Rohextrakt zu erhalten. Der Rohextrakt wurde einer Umkehrphasen-HPLC unterzogen, um N-Methoxy-1H-pyrrol-2-carboxamid (1, genannt Coumamonamid, 36,0 mg) zu erhalten. Die Gesamtmenge von 1 beträgt etwa 60 % des Rohextrakts. Daher beschlossen wir, die Eigenschaften von Coumamonamid 1 im Detail zu untersuchen.
Cumamonamid 1 ist ein weißes amorphes Pulver und hochauflösende Massenspektrometrie (HRESIMS) bestätigt C6H8N2O2 (Abb. 1). Das C2-substituierte Pyrrolfragment dieser Verbindung ist charakterisiert durch δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH im 1H-NMR-Spektrum: 4,5 Hz, H-5) und δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), und das 13C-NMR-Spektrum zeigt das Vorhandensein von vier sp2-Kohlenstoffatomen. Das Vorhandensein einer Amidgruppe an der C2-Position wurde durch HMBC-Korrelation vom C-3-Proton zum Amidcarbonylkohlenstoff bei δC 161,1 ermittelt. Darüber hinaus weisen 1 H- und 13 C-NMR-Peaks bei δH 4,10 (3H, S) und δC 68,3 auf das Vorhandensein von N-Methoxygruppen im Molekül hin. Obwohl die korrekte Position der Methoxygruppe mithilfe spektroskopischer Analysen wie verstärkter Differenzspektroskopie und Kern-Overhauser-Abkürzung (NOEDF) noch nicht bestimmt werden konnte, wurde N-Methoxy-1H-pyrrol-2-carboxamid als erste Kandidatenverbindung ausgewählt.
Um die korrekte Struktur von 1 zu bestimmen, wurde eine Totalsynthese durchgeführt (Abb. 2a). Die Behandlung des im Handel erhältlichen 2-Aminopyridins 2 mit m-CPBA führte in quantitativer Ausbeute zum entsprechenden N-Oxid 3. Nach der 2-Aminoazidierung von 2 wurde die von Abramovich beschriebene Cyclokondensationsreaktion in Benzol bei 90 °C durchgeführt, um das gewünschte 1-Hydroxy-1H-pyrrol-2-carbonitril 5 in Gramm zu erhalten. Geschwindigkeit 60 % (zwei Stufen). 15,16. Methylierung und Hydrolyse von 4 ergaben dann 1-Methoxy-1H-pyrrol-2-carbonsäure (genannt „Kumamotonsäure“, 6) in guter Ausbeute (70 %, zwei Stufen). Schließlich ergab die Amidierung über das Säurechlorid-Zwischenprodukt 6 unter Verwendung von wässrigem Ammoniak das Kumamoto-Amid 1 in 98 % Ausbeute. Alle Spektraldaten des synthetisierten 1 waren denen des isolierten 1 ähnlich, sodass die Struktur von 1 bestimmt wurde;
Allgemeine Synthese und Analyse der biologischen Aktivität von Urbenamid und Urbensäure. (a) Totalsynthese von Kumamoto-Amid. (b) Sieben Tage alte Sämlinge des Wildtyps Arabidopsis Columbia (Col) wurden auf Murashige- und Skoog-Platten (MS) gezüchtet, die Cumamonamid 6 oder Cumamonamid 1 in den angegebenen Konzentrationen enthielten. Maßstab = 1 cm.
Zunächst untersuchten wir die biologischen Aktivitäten von Urbenamid und seinen Zwischenprodukten auf ihre Fähigkeit, das Pflanzenwachstum zu modulieren. Wir gaben verschiedene Konzentrationen von Ursmonamid 1 oder Ursmonsäure 6 zu MS-Agarmedium und kultivierten Arabidopsis thaliana-Setzlinge auf diesem Medium. Diese Tests zeigten, dass hohe Konzentrationen (500 μM) von 6 das Wurzelwachstum hemmten (Abb. 2b). Als Nächstes erzeugten wir verschiedene Derivate durch Substitution der N1-Position von 6 und untersuchten mit ihnen die Struktur-Aktivitäts-Beziehung (der analoge Syntheseprozess ist in den Hintergrundinformationen (SI) beschrieben). Arabidopsis-Setzlinge wurden auf einem Medium mit 50 μM Ursonsäurederivaten gezüchtet und die Wurzellänge wurde gemessen, wie auf dem Bild gezeigt. Wie in Abbildung 3a, b und S1 dargestellt, weisen Cumaminsäuren an der N1-Position lineare Alkoxyketten unterschiedlicher Länge (9, 10, 11, 12 und 13) oder große Alkoxyketten (15, 16 und 17) auf. Die Derivate zeigten eine signifikante Hemmung des Wurzelwachstums. Darüber hinaus stellten wir fest, dass die Anwendung von 200 μM 10, 11 oder 17 die Keimung hemmte (Abbildung 3c und S2).
Untersuchung der Struktur-Wirkungs-Beziehung von Kumamotoamid und verwandten Verbindungen. (a) Struktur und Syntheseschema von Analoga. (b) Quantifizierung der Wurzellänge von 7 Tage alten Sämlingen, die auf MS-Medium mit oder ohne 50 μM Cumamonamid-Derivate gewachsen sind. Sternchen zeigen signifikante Unterschiede zur Scheinbehandlung an (t-Test, p< 0,05). n>18. Die Daten sind als Mittelwert ± SD dargestellt. nt bedeutet „nicht getestet“, da mehr als 50 % der Samen nicht keimten. (c) Quantifizierung der Keimrate behandelter Samen, die 7 Tage in MS-Medium mit oder ohne 200 μM Cumamonamid und verwandten Verbindungen inkubiert wurden. Sternchen zeigen signifikante Unterschiede zur Scheinbehandlung an (Chi-Quadrat-Test). n=96.
Interessanterweise verringerte die Zugabe von Alkylseitenketten, die länger als C9 waren, die Hemmaktivität, was darauf schließen lässt, dass mit Kumamotosäure verwandte Verbindungen Seitenketten einer bestimmten Größe benötigen, um ihre biologische Aktivität zu entfalten.
Da die Analyse der Struktur-Wirkungs-Beziehung ergab, dass C9 zu Ursonsäure modifiziert wurde und das Nonyloxyderivat der Ursonsäure (nachfolgend KAND 11 genannt) der wirksamste Wachstumshemmer war, haben wir KAND 11 genauer charakterisiert. Die Behandlung von Arabidopsis mit 50 μM KAND 11 verhinderte die Keimung fast vollständig, während niedrigere Konzentrationen (40, 30, 20 oder 10 μM) von KAND 11 das Wurzelwachstum dosisabhängig hemmten (Abb. 4a, b). Um zu testen, ob KAND 11 die Lebensfähigkeit des Wurzelmeristems beeinflusst, haben wir mit Propidiumiodid (PI) gefärbte Wurzelmeristeme untersucht und die Meristemflächengröße gemessen. Die Größe des Meristems von Sämlingen, die auf einem Medium mit 25 μM KAND-11 gewachsen sind, betrug 151,1 ± 32,5 μm, während die Größe des Meristems von Sämlingen, die auf einem Kontrollmedium mit DMSO gewachsen sind, 264,7 ± 30,8 μm betrug (Abb. 4c, d). Dies weist darauf hin, dass KAND-11 die Zellaktivität wiederherstellt. Ausbreitung. Wurzelmeristem. In Übereinstimmung damit reduzierte die Behandlung mit KAND 11 die Menge des Signals des Zellteilungsmarkers CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS im Wurzelmeristem (Abb. 4e) 17. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass KAND 11 das Wurzelwachstum durch Verringerung der Zellproliferationsaktivität hemmt.
Analyse der hemmenden Wirkung von Urbenonsäurederivaten (Urbenyloxyderivaten) auf das Wachstum. (a) 7 Tage alte Wildtyp-Col-Sämlinge, gewachsen auf MS-Platten mit den angegebenen Konzentrationen von KAND 11. Maßstab = 1 cm. (b) Quantifizierung der Wurzellänge. Buchstaben zeigen signifikante Unterschiede an (Tukey HSD-Test, p< 0,05). n>16. Die Daten sind als Mittelwert ± SD dargestellt. (c) Konfokale Mikroskopie von Propidiumiodid-gefärbten Wildtyp-Col-Wurzeln, die auf MS-Platten mit oder ohne 25 μM KAND 11 gewachsen sind. Weiße Klammern kennzeichnen das Wurzelmeristem. Maßstab = 100 µm. (d) Quantifizierung der Wurzelmeristemgröße (n = 10 bis 11). Statistische Unterschiede wurden mittels t-Test (p< 0,05). Die Balken stellen die durchschnittliche Meristemgröße dar. (e) Differentielle Interferenzkontrastmikroskopie (DIC) eines Wurzelmeristems, das das CDKB2-Konstrukt enthält; 1pro: CDKB2; 1-GUS gefärbt und gefärbt auf 5 Tage alten Sämlingen, die auf MS-Platten mit oder ohne 25 µM KAND-Test gewachsen sind.
Die Phytotoxizität von KAND 11 wurde weiter an einer anderen zweikeimblättrigen Pflanze, Tabak (Nicotiana tabacum), und einem wichtigen Landpflanzen-Modellorganismus, dem Lebermoos (Marchantia polymorpha), getestet. Wie bei Arabidopsis bildeten Tabak-SR-1-Keimlinge, die auf einem Medium mit 25 μM KAND 11 gewachsen waren, kürzere Wurzeln (Abb. 5a). Darüber hinaus keimten 40 von 48 Samen auf Platten mit 200 μM KAND 11, während alle 48 Samen auf scheinbehandeltem Medium keimten. Dies deutet darauf hin, dass höhere KAND-Konzentrationen signifikant waren (p< 0,05; Chi-Test -Quadrat) hemmte die Keimung von Tabak (Abb. 5b). Zudem war die Konzentration von KAND 11, die das Bakterienwachstum in Lebermoos hemmte, ähnlich der wirksamen Konzentration in Arabidopsis (Abb. 5c). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass KAND 11 das Wachstum einer Reihe von Pflanzen hemmen kann. Wir untersuchten dann die mögliche Zytotoxizität von mit Bear-Monoamid verwandten Verbindungen in anderen Organismen, nämlich menschlichen HeLa-Zellen und Escherichia coli Stamm DH5α als Vertretern höherer Tier- bzw. Bakterienzellen. In einer Reihe von Zellproliferationstests beobachteten wir, dass Cumamonamid 1, Cumamonamidsäure 6 und KAND 11 das Wachstum von HeLa- oder E. coli-Zellen in Konzentrationen von 100 μM nicht beeinflussten (Abb. 5d,e).
Wachstumshemmung von KAND 11 in Nicht-Arabidopsis-Organismen. (a) Zwei Wochen alte Wildtyp-SR-1-Tabaksetzlinge wurden auf vertikal positionierten MS-Platten mit 25 μM KAND 11 gezüchtet. (b) Zwei Wochen alte Wildtyp-SR-1-Tabaksetzlinge wurden auf horizontal positionierten MS-Platten mit 200 μM KAND 11 gezüchtet. (c) Zwei Wochen alte Wildtyp-Tak-1-Lebermoosknospen, gezüchtet auf Gamborg-B5-Platten mit den angegebenen KAND 11-Konzentrationen. Rote Pfeile zeigen Sporen an, die während der zweiwöchigen Inkubationszeit ihr Wachstum einstellten. (d) Zellproliferationstest von HeLa-Zellen. Die Zahl lebender Zellen wurde in festgelegten Zeitabständen mit einem Zellzählkit 8 (Dojindo) gemessen. Zur Kontrolle wurden HeLa-Zellen mit 5 μg/ml Actinomycin D (Act D) behandelt, das die RNA-Polymerase-Transkription hemmt und Zelltod verursacht. Die Analysen wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. (e) E. coli-Zellproliferationstest. Das E. coli-Wachstum wurde durch Messung der OD600 analysiert. Zur Kontrolle wurden die Zellen mit 50 μg/ml Ampicillin (Amp) behandelt, welches die bakterielle Zellwandsynthese hemmt. Die Analysen wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt.
Um den Wirkungsmechanismus der durch Uramid-verwandte Verbindungen verursachten Zytotoxizität zu entschlüsseln, haben wir Urbensäurederivate mit mäßiger Hemmwirkung erneut analysiert, wie auf dem Bild gezeigt. Wie in den Abbildungen 2b und 6a gezeigt, bildeten Setzlinge, die auf Agarplatten mit hohen Konzentrationen (200 μM) Urmotonsäure 6 gewachsen waren, kürzere und nach links gekrümmte Wurzeln (θ = – 23,7 ± 6,1), während Setzlinge, die auf dem Kontrollmedium gewachsen waren, fast gerade Wurzeln bildeten (θ = – 3,8 ± 7,1). Dieses charakteristische schräge Wachstum ist bekanntermaßen auf eine Funktionsstörung der kortikalen Mikrotubuli zurückzuführen14,18. In Übereinstimmung mit diesem Befund induzierten die Mikrotubuli-destabilisierenden Medikamente Disopyramid und Oryzalin unter unseren Wachstumsbedingungen eine ähnliche Wurzelneigung (Abb. 2b, 6a). Gleichzeitig testeten wir Urmotonsäurederivate und wählten mehrere davon aus, die in bestimmten Konzentrationen schräges Wurzelwachstum induzierten. Die Verbindungen 8, 9 und 15 änderten die Richtung des Wurzelwachstums bei 75 μM, 50 μM bzw. 40 μM, was darauf hindeutet, dass diese Verbindungen Mikrotubuli wirksam destabilisieren können (Abb. 2b, 6a). Wir testeten auch das wirksamste Ursolsäurederivat, KAND 11, bei einer niedrigeren Konzentration (15 μM) und stellten fest, dass die Anwendung von KAND 11 das Wurzelwachstum hemmte und dass die Richtung des Wurzelwachstums ungleichmäßig war, obwohl sie dazu neigten, nach links abzufallen (Abbildung C3). Da höhere Konzentrationen von Mikrotubuli-destabilisierenden Medikamenten manchmal das Pflanzenwachstum hemmen, anstatt eine Neigung der Wurzeln zu verursachen, untersuchten wir anschließend die Möglichkeit, dass KAND 11 Mikrotubuli beeinflusst, indem wir kortikale Mikrotubuli in Wurzelepidermiszellen beobachteten. Immunhistochemische Untersuchungen mit Anti-β-Tubulin-Antikörpern in Epidermiszellen von Keimlingswurzeln, die mit 25 μM KAND 11 behandelt wurden, zeigten das Verschwinden fast aller kortikalen Mikrotubuli in Epidermiszellen in der Streckungszone (Abb. 6b). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Kumamotonsäure und ihre Derivate direkt oder indirekt auf Mikrotubuli einwirken und diese zerstören. Diese Verbindungen sind neuartige Mikrotubuli-Inhibitoren.
Ursonsäure und ihre Derivate verändern die kortikalen Mikrotubuli in Arabidopsis thaliana. (a) Wurzelneigungswinkel gemessen in Gegenwart verschiedener Ursonsäurederivate in den angegebenen Konzentrationen. Die Wirkung zweier bekannter Mikrotubuli-hemmender Verbindungen, Disopyramid und Oryzalin, wurde ebenfalls untersucht. Der Einschub zeigt den Standard zur Messung des Wurzelwachstumswinkels. Sternchen zeigen signifikante Unterschiede zur Scheinbehandlung an (t-Test, p< 0,05). n>19. Maßstab = 1 cm. (b) Kortikale Mikrotubuli in Epidermiszellen in der Streckungszone. Mikrotubuli in Wildtyp-Arabidopsis-Col-Wurzeln, die auf MS-Platten mit oder ohne 25 μM KAND 11 gewachsen sind, wurden durch immunhistochemische Färbung mit β-Tubulin-Primärantikörpern und Alexa-Fluor-konjugierten Sekundärantikörpern visualisiert. Maßstab = 10 µm. (c) Mitotische Struktur von Mikrotubuli im Wurzelmeristem. Mikrotubuli wurden mittels immunhistochemischer Färbung visualisiert. Mitotische Strukturen, einschließlich Prophasezonen, Spindeln und Phragmoplasten, wurden anhand von Konfokalbildern gezählt. Pfeile zeigen mitotische Mikrotubuli-Strukturen an. Sternchen zeigen signifikante Unterschiede zur Scheinbehandlung an (t-Test, p< 0,05). n>9. Maßstab = 50 µm.
Obwohl Ursa die Fähigkeit besitzt, die Mikrotubuli-Funktion zu stören, ist sein Wirkmechanismus vermutlich anders als der typischer Mikrotubuli-Depolymerisate. Beispielsweise induzieren höhere Konzentrationen von Mikrotubuli-Depolymerisaten wie Disopyramid und Oryzalin eine anisotrope Expansion von Epidermiszellen, während dies bei KAND 11 nicht der Fall ist. Außerdem führte die gleichzeitige Anwendung von KAND 11 und Disopyramid zu einer kombinierten Disopyramid-induzierten Wurzelwachstumsreaktion, und es wurde eine KAND 11-induzierte Wachstumshemmung beobachtet (Abb. S4). Wir analysierten auch die Reaktion des hypersensitiven Disopyramid 1-1 (phs1-1)-Mutanten auf KAND 11. phs1-1 weist eine nicht-kanonische Tubulinkinase-Punktmutation auf und bildet bei Behandlung mit Disopyramid kürzere Wurzeln9,20. Sämlinge des phs1-1-Mutanten, die auf Agarmedium mit KAND 11 gewachsen sind, hatten ähnlich kurze Wurzeln wie die auf Disopyramid gewachsenen (Abb. S5).
Darüber hinaus beobachteten wir mitotische Mikrotubuli-Strukturen wie Prophasezonen, Spindeln und Phragmoplasten im Wurzelmeristem von mit KAND 11 behandelten Sämlingen. In Übereinstimmung mit den Beobachtungen für CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS wurde eine signifikante Abnahme der Anzahl mitotischer Mikrotubuli beobachtet (Abb. 6c).
Um die Zytotoxizität von KAND 11 bei subzellulärer Auflösung zu charakterisieren, behandelten wir Tabak-BY-2-Suspensionszellen mit KAND 11 und beobachteten ihre Reaktion. Um die Wirkung von KAND 11 auf kortikale Mikrotubuli zu beurteilen, gaben wir zunächst KAND 11 zu BY-2-Zellen, die TagRFP-TUA6 exprimieren, welches Mikrotubuli fluoreszierend markiert. Die Dichte der kortikalen Mikrotubuli wurde mittels Bildanalyse beurteilt, die den Prozentsatz der Zytoskelettpixel unter den Zytoplasmapixeln quantifizierte. Die Testergebnisse zeigten, dass nach einer Behandlung mit 50 μM oder 100 μM KAND 11 über eine Stunde die Dichte signifikant auf 0,94 ± 0,74 % bzw. 0,23 ± 0,28 % abnahm, während die Dichte der mit DMSO behandelten Zellen 1,61 ± 0,34 % betrug (Abb. 7a). Diese Ergebnisse stimmen mit der Beobachtung bei Arabidopsis überein, dass die Behandlung mit KAND 11 eine Depolymerisation kortikaler Mikrotubuli induziert (Abb. 6b). Wir untersuchten auch die BY-2-Linie mit GFP-ABD-markierten Aktinfilamenten nach Behandlung mit der gleichen Konzentration von KAND 11 und beobachteten, dass die Behandlung mit KAND 11 die Aktinfilamente zerstörte. Die Behandlung mit 50 μM oder 100 μM KAND 11 für 1 Stunde reduzierte die Aktinfilamentdichte signifikant auf 1,20 ± 0,62 % bzw. 0,61 ± 0,26 %, während die Dichte in DMSO-behandelten Zellen 1,69 ± 0,51 % betrug (Abb. 7b). Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu den Wirkungen von Propyzamid, das Aktinfilamente nicht beeinflusst, und Latrunculin B, einem Aktin-Depolymerisierer, der Mikrotubuli nicht beeinflusst (SI Abbildung S6). Darüber hinaus hatte die Behandlung mit Cumamonamid 1, Cumamonamidsäure 6 oder KAND 11 keine Auswirkungen auf die Mikrotubuli in HeLa-Zellen (SI Abbildung S7). Daher wird angenommen, dass sich der Wirkungsmechanismus von KAND 11 von dem bekannter Zytoskelett-Disruptoren unterscheidet. Darüber hinaus enthüllte unsere mikroskopische Beobachtung von mit KAND 11 behandelten BY-2-Zellen den Beginn des Zelltods während der KAND 11-Behandlung und zeigte, dass der Anteil der mit Evans-Blau gefärbten toten Zellen nach 30-minütiger KAND 11-Behandlung nicht signifikant anstieg, während nach 90-minütiger Behandlung mit 50 μM oder 100 μM KAND die Anzahl der toten Zellen auf 43,7 % bzw. 80,1 % anstieg (Abb. 7c). Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass das neue Ursolsäurederivat KAND 11 ein pflanzenspezifischer Zytoskelett-Inhibitor mit einem bisher unbekannten Wirkungsmechanismus ist.
KAND beeinflusst kortikale Mikrotubuli, Aktinfilamente und die Lebensfähigkeit von Tabak-BY-2-Zellen. (a) Visualisierung kortikaler Mikrotubuli in BY-2-Zellen in Gegenwart von TagRFP-TUA6. BY-2-Zellen, die mit KAND 11 (50 μM oder 100 μM) oder DMSO behandelt wurden, wurden mittels Konfokalmikroskopie untersucht. Die kortikale Mikrotubulidichte wurde aus Mikrofotografien von 25 unabhängigen Zellen berechnet. Buchstaben zeigen signifikante Unterschiede an (Tukey-HSD-Test, p< 0,05). Maßstab = 10 µm. (b) Kortikale Aktinfilamente in BY-2-Zellen, visualisiert in Gegenwart von GFP-ABD2. BY-2-Zellen, behandelt mit KAND 11 (50 µM oder 100 µM) oder DMSO, wurden mittels Konfokalmikroskopie untersucht. Die Dichte der kortikalen Aktinfilamente wurde aus Mikrofotografien von 25 unabhängigen Zellen berechnet. Buchstaben zeigen signifikante Unterschiede an (Tukey-HSD-Test, p< 0,05). Maßstab = 10 µm. (c) Beobachtung toter BY-2-Zellen durch Evans-Blau-Färbung. Mit KAND 11 (50 µM oder 100 µM) oder DMSO behandelte BY-2-Zellen wurden mittels Hellfeldmikroskopie untersucht. n=3. Maßstab = 100 µm.
Die Entdeckung und Anwendung neuer Naturprodukte hat zu bedeutenden Fortschritten in verschiedenen Bereichen des menschlichen Lebens geführt, darunter Medizin und Landwirtschaft. In der Vergangenheit wurde geforscht, um nützliche Verbindungen aus natürlichen Ressourcen zu gewinnen. Insbesondere Actinomyceten sind als nützliche antiparasitäre Antibiotika gegen Nematoden bekannt, da sie verschiedene Sekundärmetaboliten wie Avermectin, die Leitverbindung von Ivermectin, sowie Bleomycin und seine Derivate produzieren, die medizinisch als Mittel gegen Krebs eingesetzt werden21,22. Ebenso wurden verschiedene herbizide Verbindungen aus Actinomyceten entdeckt, von denen einige bereits kommerziell genutzt werden1,23. Daher gilt die Analyse von Actinomyceten-Metaboliten zur Isolierung von Naturprodukten mit gewünschten biologischen Aktivitäten als wirksame Strategie. In dieser Studie haben wir eine neue Verbindung, Coumamonamid, aus S. werraensis entdeckt und erfolgreich synthetisiert. Ursonsäure ist ein synthetisches Zwischenprodukt von Urbenamid und seinen Derivaten. Es kann zu einer charakteristischen Wurzelkräuselung führen, eine mäßige bis starke herbizide Wirkung aufweisen und die Mikrotubuli der Pflanze direkt oder indirekt schädigen. Der Wirkungsmechanismus der Urmotonsäure kann sich jedoch von dem bestehender Mikrotubuli-Inhibitoren unterscheiden, da KAND 11 auch Aktinfilamente zerstört und Zelltod verursacht, was auf einen Regulationsmechanismus hindeutet, durch den Urmotonsäure und ihre Derivate eine breite Palette von Zytoskelettstrukturen beeinflussen.
Eine weitere detaillierte Charakterisierung der Urbenonsäure wird zu einem besseren Verständnis ihres Wirkungsmechanismus beitragen. Das nächste Ziel besteht insbesondere darin, die Fähigkeit der Ursonsäure zu bewerten, an reduzierte Mikrotubuli zu binden, um festzustellen, ob Ursonsäure und ihre Derivate direkt auf Mikrotubuli wirken und diese depolymerisieren oder ob ihre Wirkung zu einer Destabilisierung der Mikrotubuli führt. Falls Mikrotubuli kein direktes Ziel sind, wird die Identifizierung des Wirkorts und der molekularen Ziele der Ursonsäure auf Pflanzenzellen außerdem dazu beitragen, die Eigenschaften verwandter Verbindungen und mögliche Wege zur Verbesserung der herbiziden Wirksamkeit besser zu verstehen. Unser Bioaktivitätstest zeigte die einzigartige zytotoxische Wirkung der Ursonsäure auf das Wachstum von Pflanzen wie Arabidopsis thaliana, Tabak und Lebermoos, während weder E. coli noch HeLa-Zellen beeinträchtigt wurden. Geringe oder nicht vorhandene Toxizität für tierische Zellen ist ein Vorteil von Ursonsäurederivaten, wenn sie als Herbizide für den Einsatz in offenen landwirtschaftlichen Feldern entwickelt werden. Da Mikrotubuli in Eukaryoten häufig vorkommen, ist ihre selektive Hemmung in Pflanzen eine wichtige Voraussetzung für Herbizide. Beispielsweise wird Propyzamid, ein Mikrotubuli-Depolymerisat, das direkt an Tubulin bindet und die Polymerisation hemmt, aufgrund seiner geringen Toxizität gegenüber tierischen Zellen als Herbizid eingesetzt24. Im Gegensatz zu Disopyramid haben verwandte Benzamide andere Zielspezifitäten. Neben pflanzlichen Mikrotubuli hemmt RH-4032 oder Benzoxamid auch Mikrotubuli tierischer Zellen bzw. Oomyceten, und Zalilamid wird aufgrund seiner geringen Phytotoxizität als Fungizid eingesetzt25,26,27. Das neu entdeckte Bear und seine Derivate zeigen selektive Zytotoxizität gegenüber Pflanzen, es ist jedoch anzumerken, dass weitere Modifikationen ihre Zielspezifität verändern und möglicherweise zusätzliche Derivate zur Kontrolle pathogener Pilze oder Oomyceten bereitstellen können.
Die einzigartigen Eigenschaften der Urbenonsäure und ihrer Derivate sind für ihre Entwicklung als Herbizide und ihre Verwendung als Forschungsinstrumente nützlich. Die Bedeutung des Zytoskeletts bei der Kontrolle der Zellform von Pflanzen ist allgemein anerkannt. Frühere Studien haben gezeigt, dass Pflanzen komplexe Mechanismen der kortikalen Mikrotubuli-Organisation entwickelt haben, indem sie die Mikrotubuli-Dynamik kontrollieren, um die Morphogenese angemessen zu steuern. Es wurde eine große Zahl von Molekülen identifiziert, die für die Regulierung der Mikrotubuli-Aktivität verantwortlich sind, und die diesbezügliche Forschung ist noch im Gange3,4,28. Unser derzeitiges Verständnis der Mikrotubuli-Dynamik in Pflanzenzellen erklärt die Mechanismen der kortikalen Mikrotubuli-Organisation nicht vollständig. Beispielsweise können zwar sowohl Disopyramid als auch Oryzalin Mikrotubuli depolymerisieren, Disopyramid verursacht jedoch schwere Wurzeldeformationen, während Oryzalin einen relativ milden Effekt hat. Darüber hinaus verursachen Mutationen im Tubulin, das Mikrotubuli stabilisiert, auch eine Rechtsrotation der Wurzeln, während dies bei Paclitaxel, das ebenfalls die Mikrotubuli-Dynamik stabilisiert, nicht der Fall ist. Daher dürfte die Untersuchung und Identifizierung der molekularen Angriffspunkte der Ursolsäure neue Erkenntnisse zur Regulation der kortikalen Mikrotubuli in Pflanzen liefern. Ebenso werden zukünftige Vergleiche von Chemikalien, die Wachstumsstörungen wirksam fördern, wie Disopyramid, und weniger wirksamen Chemikalien wie Oryzalin oder Kumamotorsäure Hinweise darauf liefern, wie es zu Wachstumsstörungen kommt.
Andererseits sind abwehrbedingte Umlagerungen des Zytoskeletts eine weitere Möglichkeit, die Zytotoxizität von Ursonsäure zu erklären. Die Infektion mit einem Pathogen oder die Einführung eines Elicitors in Pflanzenzellen führt manchmal zur Zerstörung des Zytoskeletts und anschließend zum Zelltod29. Beispielsweise wurde berichtet, dass aus Oomyceten gewonnenes Cryptoxanthin Mikrotubuli und Aktinfilamente vor dem Zelltod von Tabakzellen zerstört, ähnlich wie es bei einer KAND-Behandlung geschieht30,31. Die Ähnlichkeiten zwischen den durch Ursonsäure induzierten Abwehrreaktionen und den zellulären Reaktionen führten uns zu der Hypothese, dass sie gemeinsame zelluläre Prozesse auslösen, obwohl eine schnellere und stärkere Wirkung von Ursonsäure als von Cryptoxanthin erkennbar ist. Studien haben jedoch gezeigt, dass die Zerstörung von Aktinfilamenten den spontanen Zelltod fördert, der nicht immer mit einer Zerstörung der Mikrotubuli einhergeht29. Darüber hinaus bleibt abzuwarten, ob entweder das Pathogen oder der Elicitor ein gestörtes Wurzelwachstum verursacht, wie es bei Ursonsäurederivaten der Fall ist. Daher ist das molekulare Wissen über die Verbindung zwischen Abwehrreaktionen und dem Zytoskelett ein interessantes Forschungsthema. Durch die Nutzung des Vorhandenseins von niedermolekularen Verbindungen, die mit der Ursonsäure verwandt sind, sowie einer Reihe von Derivaten mit unterschiedlicher Wirksamkeit könnten sie Möglichkeiten bieten, unbekannte zelluläre Mechanismen zu untersuchen.
Insgesamt werden die Entdeckung und Anwendung neuer Verbindungen, die die Mikrotubuli-Dynamik modulieren, leistungsfähige Methoden zur Erforschung der komplexen molekularen Mechanismen liefern, die der Formgebung pflanzlicher Zellen zugrunde liegen. In diesem Zusammenhang könnte die kürzlich entwickelte Verbindung Urmotonsäure, die Mikrotubuli und Aktinfilamente beeinflusst und Zelltod induziert, eine Möglichkeit bieten, den Zusammenhang zwischen der Mikrotubuli-Kontrolle und diesen anderen Mechanismen zu entschlüsseln. Chemische und biologische Analysen mit Urbenonsäure werden uns somit helfen, die molekularen Regulationsmechanismen des pflanzlichen Zytoskeletts zu verstehen.
S. werraensis MK493-CF1 wird in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben mit Schikane geimpft, der 110 ml Saatmedium enthält, das aus 2 % (w/v) Galaktose, 2 % (w/v) Essence Paste, 1 % (w/v) Bacto-Zusammensetzung, Soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5 % (w/v) Maisextrakt (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0,2 % (w/v) (NH4)2SO4 und 0,2 % CaCO3 in deionisiertem Wasser besteht. (pH 7,4 vor der Sterilisation). Die Saatkulturen wurden 2 Tage lang bei 27 °C auf einem Rotationsschüttler (180 U/min) inkubiert. Produktionsanbau mittels Feststofffermentation. Die Impfkultur (7 ml) wurde in einen 500 ml K-1-Kolben überführt, der 40 g Produktionsmedium enthielt, bestehend aus 15 g gepresster Gerste (MUSO Co., Ltd., Japan) und 25 g deionisiertem Wasser (pH-Wert vor der Sterilisation nicht angepasst). Die Fermentation wurde 14 Tage lang bei 30 °C im Dunkeln durchgeführt. Das Fermentationsmaterial wurde mit 40 ml/Flasche EtOH extrahiert und zentrifugiert (1500 g, 4 °C, 10 min). Der Kulturüberstand (60 ml) wurde mit einer 10 %igen MeOH/EtOAc-Mischung extrahiert. Die organische Schicht wurde unter reduziertem Druck eingedampft, um einen Rückstand (59,5 mg) zu erhalten, der einer HPLC mit Gradientelution (0–10 Minuten: 90 %) auf einer Umkehrphasensäule (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × Länge 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 Minuten: 90 % H2O/CH3CN bis 70 % H2O/CH3CN (Gradient), 35–45 Minuten: 90 % H2O/EtOH, 45–155 Minuten: 90 % H2O/EtOH bis 100 % EtOH (Gradient, 155–200 min: 100 % EtOH) bei einer Flussrate von 1,5 ml/min unterzogen wurde. Cumamonamid (1, 36,0 mg) wurde als weißes amorphes Pulver isoliert.
Kumamotoamid(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t , J = 3,8 Hz, 1H). ), 4,08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ berechneter Wert: 141,0659, gemessener Wert: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Columbia-Samen (Col-0) wurden mit Genehmigung für Forschungszwecke vom Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) bezogen. Col-0-Samen wurden unter unseren Laborbedingungen vermehrt und gepflegt und als Wildtyp-Arabidopsis-Pflanzen verwendet. Arabidopsis-Samen wurden oberflächensterilisiert und in halbkonzentriertem Murashige- und Skoog-Medium mit 2 % Saccharose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05 % (w/v) 2-(4-Morpholino)ethansulfonsäure (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) und 1,5 % Agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, bei 23 °C und Dauerlicht kultiviert. Samen des phs1-1-Mutanten wurden von T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) bereitgestellt.
Samen des Stammes SR-1 wurden von T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) bereitgestellt und als Wildtyp-Tabakpflanzen verwendet. Die Tabaksamen wurden oberflächensterilisiert und drei Nächte in sterilem Wasser eingeweicht, um die Keimung zu fördern. Anschließend wurden sie in eine halbkonzentrierte Lösung mit 2 % Saccharose, 0,05 % (w/v) MES und 0,8 % Gellangummi (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige und Skoog-Medium) mit einem pH-Wert von 5,7 gegeben und bei 23 °C unter konstantem Licht inkubiert.
Stamm Tak-1 wurde von T. Kohchi (Universität Kyoto) bereitgestellt und als Standard-Versuchseinheit für die Lebermoosstudie verwendet. Gemma wurde aus sterilisierten Kulturpflanzen gewonnen und anschließend auf Gamborg B5-Medium (Fujifilm Wako Pure Chemical) mit 1 % Saccharose und 0,3 % Gellangummi ausgesät und bei 23 °C unter Dauerlicht inkubiert.
Tabak-BY-2-Zellen (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) wurden von S. Hasezawa (Universität Tokio) bereitgestellt. BY-2-Zellen wurden 95-fach in modifiziertem Linsmeier- und Skoog-Medium verdünnt und wöchentlich mit 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure 32 ergänzt. Die Zellsuspension wurde auf einem Rotationsschüttler bei 130 U/min bei 27 °C im Dunkeln gemischt. Zellen mit der 10-fachen Menge an frischem Medium waschen und im gleichen Medium resuspendieren. BY-2-transgene Zelllinien, die den Mikrotubuli-Marker TagRFP-TUA6 oder den Aktinfilament-Marker GFP-ABD2 unter dem Blumenkohlmosaikvirus-35S-Promoter stabil exprimieren, wurden wie beschrieben erzeugt33,34,35. Diese Zelllinien können mit ähnlichen Verfahren wie die für die ursprüngliche BY-2-Zelllinie verwendeten erhalten und synchronisiert werden.
HeLa-Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) (Life Technologies), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 1,2 U/ml Penicillin und 1,2 μg/ml Streptomycin, in einem 37 °C warmen Inkubator mit 5 % CO2 kultiviert.
Alle in diesem Manuskript beschriebenen Experimente wurden in Übereinstimmung mit den japanischen Vorschriften und Richtlinien zur biologischen Sicherheit durchgeführt.
Verbindungen wurden in Dimethylsulfoxid (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) als Stammlösungen gelöst und in MS-Medium für Arabidopsis und Tabak oder Gamborg B5-Medium für Lebermoos verdünnt. Für den Test zur Hemmung des Wurzelwachstums wurden mehr als 10 Samen pro Platte auf Agarmedium mit den angegebenen Verbindungen oder DMSO ausgesät. Die Samen wurden 7 Tage in einer Wachstumskammer inkubiert. Die Sämlinge wurden fotografiert und die Länge der Wurzeln gemessen. Für den Arabidopsis-Keimungstest wurden 48 Samen pro Platte auf Agarmedium mit 200 μM Verbindung oder DMSO ausgesät. Arabidopsis-Samen wurden in einer Wachstumskammer gezüchtet und die Anzahl der gekeimten Sämlinge wurde 7 Tage nach der Keimung (dag) gezählt. Für den Tabak-Keimungstest wurden 24 Samen pro Platte auf Agarmedium mit 200 μM KAND oder DMSO ausgesät. Tabaksamen wurden in einer Wachstumskammer gezüchtet und die Anzahl der gekeimten Sämlinge nach 14 Tagen gezählt. Für den Lebermoos-Wachstumshemmungstest wurden 9 Embryonen von jeder Platte auf Agarmedium mit den angegebenen Konzentrationen von KAND oder DMSO plattiert und 14 Tage in einer Wachstumskammer inkubiert.
Verwenden Sie mit 5 mg/ml Propidiumiodid (PI) gefärbte Sämlinge, um die Organisation des Wurzelmeristems zu visualisieren. PI-Signale wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung eines konfokalen TCS SPE-Laser-Scanning-Mikroskops (Leica Microsystems) beobachtet.
Die histochemische Färbung der Wurzeln mit β-Glucuronidase (GUS) erfolgte nach dem von Malami und Benfey36 beschriebenen Protokoll. Die Sämlinge wurden über Nacht in 90 % Aceton fixiert, 1 Stunde lang mit 0,5 mg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-d-glucuronsäure in GUS-Puffer gefärbt und in eine hydratisierte Chloraldehydlösung (8 g Chloralhydrat, 2 ml Wasser und 1 ml Glycerin) gegeben und mittels differentieller Interferenzkontrastmikroskopie unter Verwendung eines Axio Imager M1-Mikroskops (Carl Zeiss) beobachtet.
Die Wurzelwinkel wurden an 7 Tage alten Setzlingen gemessen, die auf vertikal aufgestellten Platten gewachsen waren. Messen Sie den Winkel der Wurzel aus der Richtung des Schwerkraftvektors, wie in Schritt 6 beschrieben.
Die Anordnung der kortikalen Mikrotubuli wurde wie beschrieben beobachtet, mit geringfügigen Änderungen am Protokoll 37. Anti-β-Tubulin-Antikörper (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) und Alexa Fluor 488-konjugiertes Anti-Maus-IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) wurden als primäre und sekundäre Antikörper in Verdünnungen von 1:1000 bzw. 1:100 verwendet. Fluoreszenzbilder wurden mit einem konfokalen TCS SPE-Laser-Scanning-Mikroskop (Leica Microsystems) aufgenommen. Nehmen Sie Z-Stapel-Bilder auf und erstellen Sie Maximalintensitätsprojektionen gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Der HeLa-Zellproliferationstest wurde mit dem Cell Counting Kit 8 (Dojindo) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
Das Wachstum von E. coli DH5α wurde durch Messung der Zelldichte in der Kultur mit einem Spektrophotometer bei 600 nm (OD600) analysiert.
Die zytoskelettale Organisation in transgenen BY-2-Zellen wurde mit einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet, das mit einem konfokalen CSU-X1-Scanner (Yokogawa) und einer sCMOS-Kamera (Zyla, Andor Technology) ausgestattet war. Die zytoskelettale Dichte wurde durch Bildanalyse ermittelt, die den Prozentsatz der zytoskelettalen Pixel unter den zytoplasmatischen Pixeln in konfokalen Bildern mit der Software ImageJ wie beschrieben quantifizierte38,39.
Um den Zelltod in BY-2-Zellen zu erkennen, wurde ein Aliquot der Zellsuspension 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 0,05 % Evans-Blau inkubiert. Die selektive Evans-Blau-Färbung toter Zellen beruht auf der Extrusion des Farbstoffs aus lebenden Zellen durch die intakte Plasmamembran40. Die gefärbten Zellen wurden mit einem Hellfeldmikroskop (BX53, Olympus) beobachtet.
HeLa-Zellen wurden in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 gezüchtet. Die Zellen wurden 6 Stunden lang bei 37 °C mit 100 μM KAND 11, Kumamonaminsäure 6, Kumamonamid 1, 100 ng/ml Colcemid (Gibco) oder 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) behandelt. Die Zellen wurden 10 Minuten lang mit MetOH und dann 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Acetat fixiert. Die fixierten Zellen wurden 2 Stunden lang mit β-Tubulin-Primärantikörper (1D4A4, Proteintech: 66240-1), verdünnt in 0,5 % BSA/PBS, inkubiert, dreimal mit TBST gewaschen und dann mit Alexa Fluor-Ziegenantikörper inkubiert. 488 1 Stunde. – Maus-IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) und 15 ng/ml 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), verdünnt in 0,5 % BSA/PBS. Nach dreimaligem Waschen mit TBST wurden die gefärbten Zellen mit einem Nikon Eclipse Ti-E-Invertmikroskop untersucht. Die Bilder wurden mit einer gekühlten Hamamatsu ORCA-R2 CCD-Kamera unter Verwendung der Software MetaMorph (Molecular Devices) aufgenommen.
Veröffentlichungszeit: 17. Juni 2024