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Die Entdeckung und der wohltuende Einsatz natürlicher Produkte können dazu beitragen, das menschliche Leben zu verbessern.Pflanzenwachstumshemmende Chemikalien werden häufig als Herbizide zur Unkrautbekämpfung eingesetzt.Aufgrund der Notwendigkeit, unterschiedliche Arten von Herbiziden einzusetzen, besteht die Notwendigkeit, Verbindungen mit neuen Wirkmechanismen zu identifizieren.In dieser Studie haben wir eine neue N-Alkoxypyrrol-Verbindung, Coumamonamid, aus Streptomyces werraensis MK493-CF1 entdeckt und den vollständigen Syntheseprozess etabliert.Durch biologische Aktivitätstests haben wir entdeckt, dass Urs-Monoaminsäure ein synthetisches Zwischenprodukt von Urs-Monoamid und ein Potenzial dafür istPflanzenwachstumshemmer.Darüber hinaus haben wir verschiedene Urbenonsäure-Derivate entwickelt, darunter das Urbenyloxy-Derivat (UDA), das eine hohe herbizide Wirkung aufweist, ohne das Wachstum von HeLa-Zellen negativ zu beeinflussen.Wir fanden auch heraus, dass Urmotonsäure-Derivate pflanzliche Mikrotubuli zerstören;Darüber hinaus beeinflusst KAND Aktinfilamente und induziert den Zelltod.Diese vielfältigen Wirkungen unterscheiden sich von denen bekannter Mikrotubuli-Inhibitoren und legen einen neuen Wirkmechanismus für Ursonsäure nahe, der einen wichtigen Vorteil bei der Entwicklung neuer Herbizide darstellt.
Die Entdeckung und praktische Anwendung nützlicher Naturstoffe und ihrer Derivate ist ein Mittel zur Verbesserung der Lebensqualität des Menschen.Von Mikroorganismen, Pflanzen und Insekten produzierte Sekundärmetaboliten haben zu großen Fortschritten in der Medizin und Landwirtschaft geführt.Viele Antibiotika und Medikamente gegen Leukämie wurden aus Naturprodukten entwickelt.Darüber hinaus verschiedene Arten vonPestizideAus diesen Naturprodukten werden Fungizide und Herbizide für den Einsatz in der Landwirtschaft gewonnen.Insbesondere Herbizide zur Unkrautbekämpfung sind wichtige Instrumente zur Steigerung der Ernteerträge in der modernen Landwirtschaft, und verschiedene Arten von Verbindungen werden bereits kommerziell eingesetzt.Mehrere zelluläre Prozesse in Pflanzen, wie Photosynthese, Aminosäurestoffwechsel, Zellwandsynthese, Regulierung der Mitose, Phytohormon-Signalisierung oder Proteinsynthese, gelten als typische Ziele von Herbiziden.Verbindungen, die die Funktion von Mikrotubuli hemmen, sind eine häufige Klasse von Herbiziden, die das Pflanzenwachstum beeinflussen, indem sie die mitotische Regulation beeinflussen2.
Mikrotubuli sind Bestandteile des Zytoskeletts und in eukaryotischen Zellen weitgehend konserviert.Das Tubulin-Heterodimer besteht aus α-Tubulin und β-Tubulin, die lineare Mikrotubuli-Protofilamente bilden, wobei 13 Protofilamente eine zylindrische Struktur bilden.Mikrotubuli spielen in Pflanzenzellen mehrere Rollen, einschließlich der Bestimmung der Zellform, der Zellteilung und des intrazellulären Transports3,4.Pflanzenzellen enthalten Mikrotubuli unter der Interphase-Plasmamembran, und es wird angenommen, dass diese sogenannten kortikalen Mikrotubuli die Organisation von Cellulose-Mikrofibrillen durch die Regulierung von Cellulose-Synthase-Komplexen steuern4,5.Kortikale Mikrotubuli der Wurzelepidermiszellen, die sich in der Zone der schnellen Dehnung der Wurzelspitze befinden, befinden sich seitlich, und Zellulosemikrofasern folgen diesen Mikrotubuli und begrenzen die Richtung der Zellausdehnung und fördern so die anisotrope Zelldehnung.Daher hängt die Funktion der Mikrotubuli eng mit der Pflanzenmorphologie zusammen.Aminosäuresubstitutionen in Genen, die für Tubulin kodieren, verursachen eine Schiefe der kortikalen Mikrotubuli-Anordnungen und ein links- oder rechtsseitiges Wachstum bei Arabidopsis 6,7.Ebenso können Mutationen in Mikrotubuli-assoziierten Proteinen, die die Mikrotubuli-Dynamik regulieren, auch zu einem verzerrten Wurzelwachstum führen8,9,10,11,12,13.Darüber hinaus führt die Behandlung mit Mikrotubuli zerstörenden Herbiziden wie Disopyramid, auch bekannt als Pretilachlor, ebenfalls zu einem linksseitigen schrägen Wurzelwachstum14.Diese Daten zeigen, dass eine präzise Regulierung der Mikrotubuli-Funktion entscheidend für die Bestimmung der Wachstumsrichtung der Pflanze ist.
Es wurden verschiedene Arten von Mikrotubuli-Inhibitoren entdeckt, und diese Medikamente haben bedeutende Beiträge zur Zytoskelettforschung sowie zur Landwirtschaft und Medizin geleistet2.Insbesondere Oryzalin, Dinitroanilinverbindungen, Disopyramid, Benzamid-verwandte Verbindungen und ihre Analoga können die Funktion von Mikrotubuli hemmen und dadurch das Pflanzenwachstum hemmen.Daher werden sie häufig als Herbizide eingesetzt.Da Mikrotubuli jedoch ein wichtiger Bestandteil pflanzlicher und tierischer Zellen sind, sind die meisten Mikrotubuli-Inhibitoren für beide Zelltypen zytotoxisch.Daher wird trotz ihrer anerkannten Nützlichkeit als Herbizide eine begrenzte Anzahl von Antimikrotubuli-Wirkstoffen für praktische Zwecke verwendet.
Streptomyces ist eine Gattung der Familie Streptomyces, zu der aerobe, grampositive, filamentöse Bakterien gehören und die weithin für ihre Fähigkeit bekannt ist, eine Vielzahl sekundärer Metaboliten zu produzieren.Daher gilt es als eine der wichtigsten Quellen für neue biologisch aktive Naturstoffe.In der aktuellen Studie haben wir eine neue Verbindung namens Coumamonamid entdeckt, die aus Streptomyces werraensis MK493-CF1 und S. werraensis ISP 5486 isoliert wurde. Mittels Spektralanalyse und vollständiger Spektralanalyse wurde die Struktur von Coumamonamid und sein einzigartiges N-Alkoxypyrrol-Gerüst charakterisiert wurde festgelegt.Synthese.Es wurde festgestellt, dass Ursmonsäure, ein synthetisches Zwischenprodukt von Ursmonoamid und seinen Derivaten, das Wachstum und die Keimung der beliebten Modellpflanze Arabidopsis thaliana hemmt.In einer Struktur-Aktivitäts-Beziehungsstudie haben wir herausgefunden, dass eine Verbindung mit zu Ursonsäure modifiziertem C9, genannt Nonyloxyderivat von Ursonsäure (KAND), die hemmende Wirkung auf Wachstum und Keimung deutlich verstärkt.Bemerkenswert ist, dass der neu entdeckte Pflanzenwachstumshemmer auch das Wachstum von Tabak und Leberblümchen beeinflusste und weder für Bakterien noch für HeLa-Zellen zytotoxisch war.Darüber hinaus induzieren einige Urmotonsäure-Derivate einen verzerrten Wurzelphänotyp, was darauf hindeutet, dass diese Derivate direkt oder indirekt Mikrotubuli beeinflussen.In Übereinstimmung mit dieser Idee deuten unsere Beobachtungen von Mikrotubuli, die entweder immunhistochemisch oder mit fluoreszierenden Proteinen markiert sind, darauf hin, dass die KAND-Behandlung Mikrotubuli depolymerisiert.Darüber hinaus zerstörte die Behandlung mit Kumamotonsäure-Derivaten die Aktin-Mikrofilamente.Damit haben wir einen neuen Pflanzenwachstumshemmer entdeckt, dessen einzigartiger Wirkmechanismus die Zerstörung des Zytoskeletts beinhaltet.
Der Stamm MK493-CF1 wurde in Shinagawa-ku, Tokio, aus Erde isoliert.Der Stamm MK493-CF1 bildete gut verzweigtes Stroma-Myzel.Die Teilsequenz des 16S-ribosomalen RNA-Gens (1422 bp) wurde bestimmt.Dieser Stamm ist S. werraensis sehr ähnlich (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: typischer Stamm, 99,93 %).Basierend auf diesem Ergebnis wurde festgestellt, dass dieser Stamm eng mit dem Typstamm von S. werraensis verwandt war.Daher haben wir diesen Stamm vorläufig S. werraensis MK493-CF1 genannt.Auch S. werraensis ISP 5486T produziert die gleichen bioaktiven Verbindungen.Da die Gewinnung von Naturstoffen aus diesem Mikroorganismus zunächst kaum erforscht war, wurden weitere chemische Untersuchungen durchgeführt.Nach der Kultivierung von S. werraensis MK493-CF1 auf Gerstenmedium durch Festkörperfermentation bei 30 °C für 14 Tage wurde das Medium mit 50 % EtOH extrahiert.60 ml Probe wurden getrocknet, um 59,5 mg Rohextrakt zu erhalten.Der Rohextrakt wurde einer Umkehrphasen-HPLC unterzogen, um N-Methoxy-1H-pyrrol-2-carboxamid (1, genannt Cumamonamid, 36,0 mg) zu ergeben.Die Gesamtmenge an 1 beträgt ca. 60 % des Rohextrakts.Daher haben wir uns entschieden, die Eigenschaften von Kumamotoamid 1 im Detail zu untersuchen.
Coumamonamid 1 ist ein weißes amorphes Pulver und hochauflösende Massenspektrometrie (HRESIMS) bestätigt C6H8N2O2 (Abb. 1).Das C2-substituierte Pyrrolfragment dieser Verbindung ist durch δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH im 1H-NMR-Spektrum: 4,5 Hz) gekennzeichnet , H-5) und δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), und das 13C-NMR-Spektrum zeigt die Anwesenheit von vier sp2-Kohlenstoffatomen.Das Vorhandensein einer Amidgruppe an der C2-Position wurde durch HMBC-Korrelation vom C-3-Proton zum Amidcarbonylkohlenstoff bei δC 161,1 beurteilt.Darüber hinaus weisen 1 H- und 13 C-NMR-Peaks bei δH 4,10 (3H, S) und δC 68,3 auf das Vorhandensein von N-Methoxygruppen im Molekül hin.Obwohl die korrekte Position der Methoxygruppe mithilfe spektroskopischer Analysen wie der verstärkten Differenzspektroskopie und der nuklearen Overhauser-Abkürzung (NOEDF) noch nicht bestimmt werden konnte, wurde N-Methoxy-1H-pyrrol-2-carboxamid zur ersten Kandidatenverbindung.
Um die korrekte Struktur von 1 zu bestimmen, wurde eine Totalsynthese durchgeführt (Abb. 2a).Die Behandlung von kommerziell erhältlichem 2-Aminopyridin 2 mit m-CPBA führte zum entsprechenden N-Oxid 3 in quantitativer Ausbeute.Nach der 2-Aminoazidierung von 2 wurde die von Abramovich beschriebene Cyclokondensationsreaktion in Benzol bei 90 °C durchgeführt, um das gewünschte 1-Hydroxy-1H-pyrrol-2-carbonitril 5 in Gramm zu erhalten.Geschwindigkeit 60 % (zwei Stufen).15,16.Methylierung und Hydrolyse von 4 ergaben dann 1-Methoxy-1H-pyrrol-2-carbonsäure (genannt „Cumotonsäure“, 6) in guter Ausbeute (70 %, zwei Schritte).Schließlich ergab die Amidierung über das Säurechlorid-Zwischenprodukt 6 mit wässrigem Ammoniak Kumamoto-Amid 1 in 98 % Ausbeute.Alle Spektraldaten des synthetisierten 1 waren denen des isolierten 1 ähnlich, daher wurde die Struktur von 1 bestimmt;
Allgemeine Synthese und Analyse der biologischen Aktivität von Urbenamid und Urbensäure.(a) Totalsynthese von Kumamoto-Amid.(b) Sieben Tage alte Wildtyp-Sämlinge von Arabidopsis Columbia (Col) wurden auf Platten von Murashige und Skoog (MS) gezüchtet, die Coumamonamid 6 oder Coumamonamid 1 in den angegebenen Konzentrationen enthielten.Maßstabsbalken = 1 cm.
Zunächst untersuchten wir die biologischen Aktivitäten von Urbenamid und seinen Zwischenprodukten auf ihre Fähigkeit, das Pflanzenwachstum zu modulieren.Wir fügten dem MS-Agarmedium verschiedene Konzentrationen von Ursmonamid 1 oder Ursmonsäure 6 hinzu und kultivierten Arabidopsis thaliana-Keimlinge auf diesem Medium.Diese Tests zeigten, dass hohe Konzentrationen (500 μM) von 6 das Wurzelwachstum hemmten (Abb. 2b).Als nächstes erzeugten wir verschiedene Derivate durch Substitution der N1-Position von 6 und führten Struktur-Aktivitäts-Beziehungsstudien an ihnen durch (der analoge Syntheseprozess ist in den Hintergrundinformationen (SI) beschrieben).Arabidopsis-Sämlinge wurden auf einem Medium gezüchtet, das 50 μM Ursonsäurederivate enthielt, und die Wurzellänge wurde gemessen.wie es auf dem Bild gezeigt wird.Wie in den Abbildungen 3a, b und S1 gezeigt, weisen Cumamosäuren unterschiedlich lange lineare Alkoxyketten (9, 10, 11, 12 und 13) oder große Alkoxyketten (15, 16 und 17) an der N1-Position auf.Die Derivate zeigten eine signifikante Hemmung des Wurzelwachstums.Darüber hinaus stellten wir fest, dass die Anwendung von 200 μM 10, 11 oder 17 die Keimung hemmte (Abb. 3c und S2).
Untersuchung der Struktur-Aktivitäts-Beziehung von Kumamoto-Amid und verwandten Verbindungen.(a) Struktur und Syntheseschema von Analoga.(b) Quantifizierung der Wurzellänge von 7 Tage alten Sämlingen, die auf MS-Medium mit oder ohne 50 μM Cumamonamid-Derivate gewachsen sind.Sternchen weisen auf signifikante Unterschiede zur Scheinbehandlung hin (t-Test, S< 0,05).n>18. Die Daten werden als Mittelwert ± SD angezeigt.nt bedeutet „nicht getestet“, da mehr als 50 % der Samen nicht gekeimt sind.(c) Quantifizierung der Keimungsrate behandelter Samen, die 7 Tage lang in MS-Medium mit oder ohne 200 μM Coumamonamid und verwandte Verbindungen inkubiert wurden.Sternchen weisen auf signifikante Unterschiede zur Scheinbehandlung (Chi-Quadrat-Test) hin.n=96.
Interessanterweise verringerte die Zugabe von Alkylseitenketten, die länger als C9 sind, die Hemmwirkung, was darauf hindeutet, dass mit Kumamotoinsäure verwandte Verbindungen Seitenketten einer bestimmten Größe benötigen, um ihre biologische Aktivität zu entfalten.
Da die Struktur-Aktivitäts-Beziehungsanalyse zeigte, dass C9 zu Ursonsäure modifiziert wurde und das Nonyloxyderivat von Ursonsäure (im Folgenden als KAND 11 bezeichnet) der wirksamste Pflanzenwachstumshemmer war, führten wir eine detailliertere Charakterisierung von KAND 11 durch. Behandlung von Arabidopsis mit 50 μM KAND 11 wurde die Keimung fast vollständig verhindert, wohingegen niedrigere Konzentrationen (40, 30, 20 oder 10 μM) von KAND 11 das Wurzelwachstum dosisabhängig hemmten (Abb. 4a, b).Um zu testen, ob KAND 11 die Lebensfähigkeit des Wurzelmeristems beeinflusst, untersuchten wir mit Propidiumiodid (PI) gefärbte Wurzelmeristeme und maßen die Meristemflächengröße.Die Größe des Meristems von Sämlingen, die auf einem Medium mit 25 μM KAND-11 gewachsen waren, betrug 151,1 ± 32,5 μm, während die Größe des Meristems von Sämlingen, die auf einem Kontrollmedium mit DMSO gewachsen waren, 264,7 ± 30,8 μm betrug (Abb. 4c, d). , was darauf hinweist, dass KAND-11 die Zellaktivität wiederherstellt.Verbreitung.Wurzelmeristem.In Übereinstimmung damit reduzierte die Behandlung mit KAND 11 die Menge des Zellteilungsmarkers CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS-Signal im Wurzelmeristem (Abb. 4e) 17 .Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass KAND 11 das Wurzelwachstum hemmt, indem es die Zellproliferationsaktivität reduziert.
Analyse der hemmenden Wirkung von Urbenonsäure-Derivaten (Urbenyloxy-Derivaten) auf das Wachstum.(a) 7 Tage alte Wildtyp-Col-Sämlinge, die auf MS-Platten mit den angegebenen Konzentrationen von KAND 11 gewachsen sind. Maßstabsbalken = 1 cm.(b) Quantifizierung der Wurzellänge.Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede hin (Tukey HSD-Test, S< 0,05).n>16. Die Daten werden als Mittelwert ± SD angezeigt.(c) Konfokale Mikroskopie von Propidiumiodid-gefärbten Wildtyp-Col-Wurzeln, die auf MS-Platten mit oder ohne 25 μM KAND 11 gewachsen sind. Weiße Klammern zeigen das Wurzelmeristem an.Maßstabsbalken = 100 µm.(d) Quantifizierung der Wurzelmeristemgröße (n = 10 bis 11).Statistische Unterschiede wurden mithilfe des T-Tests ermittelt (S< 0,05).Die Balken stellen die durchschnittliche Meristemgröße dar.(e) Differential-Interferenzkontrast-Mikroskopie (DIC) eines Wurzelmeristems, das das CDKB2-Konstrukt enthält;1pro: CDKB2;1-GUS gefärbt und gefärbt auf 5 Tage alten Sämlingen, die auf MS-Platten mit oder ohne 25 µM KAND-Assay gewachsen sind.
Die Phytotoxizität von KAND 11 wurde weiter an einer anderen zweikeimblättrigen Pflanze, dem Tabak (Nicotiana tabacum), und einem wichtigen Landpflanzen-Modellorganismus, dem Leberblümchen (Marchantia polymorpha), getestet.Wie im Fall von Arabidopsis produzierten Tabak-SR-1-Sämlinge, die auf Medium mit 25 μM KAND 11 gewachsen waren, kürzere Wurzeln (Abb. 5a).Darüber hinaus keimten 40 von 48 Samen auf Platten mit 200 μM KAND 11, während alle 48 Samen auf scheinbehandelten Medien keimten, was darauf hindeutet, dass höhere KAND-Konzentrationen signifikant waren (S< 0,05;Chi-Test-Quadrat) hemmte die Keimung von Tabak.(Abb. 5b).Darüber hinaus war die Konzentration von KAND 11, die das Bakterienwachstum im Leberblümchen hemmte, ähnlich der wirksamen Konzentration in Arabidopsis (Abb. 5c).Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass KAND 11 das Wachstum einer Vielzahl von Pflanzen hemmen kann.Anschließend untersuchten wir die mögliche Zytotoxizität von Bärenmonoamid-verwandten Verbindungen in anderen Organismen, nämlich menschlichen HeLa-Zellen und dem Escherichia coli-Stamm DH5α, als Vertreter höherer tierischer bzw. bakterieller Zellen.In einer Reihe von Zellproliferationstests beobachteten wir, dass Cumamonamid 1, Cumamonamidsäure 6 und KAND 11 das Wachstum von HeLa- oder E. coli-Zellen bei Konzentrationen von 100 μM nicht beeinflussten (Abb. 5d, e).
Wachstumshemmung von KAND 11 in Nicht-Arabidopsis-Organismen.(a) Zwei Wochen alte Wildtyp-SR-1-Tabakkeimlinge wurden auf vertikal positionierten MS-Platten gezüchtet, die 25 μM KAND 11 enthielten. (b) Zwei Wochen alte Wildtyp-SR-1-Tabakkeimlinge wurden auf horizontal positionierten Platten gezüchtet MS-Platten mit 200 μM KAND 11. (c) Zwei Wochen alte Wildtyp-Tak-1-Leberblümchenknospen, die auf Gamborg B5-Platten mit den angegebenen Konzentrationen von KAND 11 gewachsen sind. Rote Pfeile zeigen Sporen an, die innerhalb der zweiwöchigen Inkubation aufgehört haben zu wachsen Zeitraum.(d) Zellproliferationsassay von HeLa-Zellen.Die Anzahl lebensfähiger Zellen wurde in festgelegten Zeitintervallen mit einem Zellzählkit 8 (Dojindo) gemessen.Als Kontrolle wurden HeLa-Zellen mit 5 μg/ml Actinomycin D (Act D) behandelt, das die Transkription der RNA-Polymerase hemmt und zum Zelltod führt.Die Analysen wurden dreifach durchgeführt.(e) E. coli-Zellproliferationstest.Das Wachstum von E. coli wurde durch Messung der OD600 analysiert.Als Kontrolle wurden Zellen mit 50 μg/ml Ampicillin (Amp) behandelt, das die bakterielle Zellwandsynthese hemmt.Die Analysen wurden dreifach durchgeführt.
Um den Wirkungsmechanismus der durch Uramid-verwandte Verbindungen verursachten Zytotoxizität zu entschlüsseln, haben wir Urbensäurederivate mit mäßiger Hemmwirkung erneut analysiert.wie es auf dem Bild gezeigt wird.Wie in den Abbildungen 2b, 6a gezeigt, produzierten Sämlinge, die auf Agarplatten mit hohen Konzentrationen (200 μM) Urmotonsäure 6 wuchsen, kürzere und linksgekrümmte Wurzeln (θ = – 23,7 ± 6,1), während Sämlinge, die auf dem Kontrollmedium wuchsen, die Sämlinge produzierten fast gerade Wurzeln (θ = – 3,8 ± 7,1).Es ist bekannt, dass dieses charakteristische Schrägwachstum auf eine Funktionsstörung der kortikalen Mikrotubuli zurückzuführen ist14,18.In Übereinstimmung mit diesem Befund induzierten die Mikrotubuli-destabilisierenden Medikamente Disopyramid und Oryzalin unter unseren Wachstumsbedingungen eine ähnliche Wurzelneigung (Abb. 2b, 6a).Gleichzeitig haben wir Urmotonsäure-Derivate getestet und mehrere davon ausgewählt, die in bestimmten Konzentrationen ein schräges Wurzelwachstum induzierten.Die Verbindungen 8, 9 und 15 änderten die Richtung des Wurzelwachstums bei 75 μM, 50 μM bzw. 40 μM, was darauf hinweist, dass diese Verbindungen Mikrotubuli effektiv destabilisieren können (Abb. 2b, 6a).Wir testeten auch das wirksamste Ursolsäurederivat, KAND 11, in einer niedrigeren Konzentration (15 µM) und stellten fest, dass die Anwendung von KAND 11 das Wurzelwachstum hemmte und dass die Richtung des Wurzelwachstums ungleichmäßig war, obwohl sie dazu neigte, nach links abzufallen ( Abbildung C3)..Da höhere Konzentrationen von Mikrotubuli-destabilisierenden Arzneimitteln manchmal das Pflanzenwachstum eher hemmen als zu einer Wurzelneigung führen, beurteilten wir anschließend die Möglichkeit, dass KAND 11 Mikrotubuli beeinflusst, indem wir kortikale Mikrotubuli in Wurzelepidermiszellen beobachteten.Die Immunhistochemie unter Verwendung von Anti-β-Tubulin-Antikörpern in Epidermiszellen von Sämlingswurzeln, die mit 25 μM KAND 11 behandelt wurden, zeigte das Verschwinden fast aller kortikalen Mikrotubuli in Epidermiszellen in der Elongationszone (Abb. 6b).Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Kumamotonsäure und ihre Derivate direkt oder indirekt auf Mikrotubuli wirken und diese zerstören, und dass diese Verbindungen neuartige Mikrotubuli-Inhibitoren sind.
Ursonsäure und ihre Derivate verändern kortikale Mikrotubuli in Arabidopsis thaliana.(a) Wurzelneigungswinkel, gemessen in Gegenwart verschiedener Urmotonsäurederivate in den angegebenen Konzentrationen.Die Wirkung von zwei Verbindungen, von denen bekannt ist, dass sie Mikrotubuli hemmen: Disopyramid und Oryzalin, wurden ebenfalls analysiert.Der Einschub zeigt den Standard, der zur Messung des Wurzelwachstumswinkels verwendet wird.Sternchen weisen auf signifikante Unterschiede zur Scheinbehandlung hin (t-Test, S< 0,05).n>19. Maßstabsbalken = 1 cm.(b) Kortikale Mikrotubuli in Epidermiszellen in der Elongationszone.Mikrotubuli in Wildtyp-Arabidopsis-Col-Wurzeln, die auf MS-Platten mit oder ohne 25 μM KAND 11 gewachsen waren, wurden durch immunhistochemische Färbung unter Verwendung von β-Tubulin-Primärantikörpern und Alexa Fluor-konjugierten Sekundärantikörpern sichtbar gemacht.Maßstabsbalken = 10 µm.(c) Mitotische Struktur von Mikrotubuli im Wurzelmeristem.Mikrotubuli wurden mittels immunhistochemischer Färbung sichtbar gemacht.Mitotische Strukturen, einschließlich Prophasezonen, Spindeln und Phragmoplasten, wurden anhand konfokaler Bilder gezählt.Pfeile zeigen mitotische Mikrotubulistrukturen an.Sternchen weisen auf signifikante Unterschiede zur Scheinbehandlung hin (t-Test, S< 0,05).n>9. Maßstabsbalken = 50 µm.
Obwohl Ursa die Fähigkeit besitzt, die Funktion von Mikrotubuli zu stören, wird erwartet, dass sich sein Wirkungsmechanismus von typischen Mitteln zur Depolymerisierung von Mikrotubuli unterscheidet.Beispielsweise induzieren höhere Konzentrationen von Mikrotubuli-depolymerisierenden Mitteln wie Disopyramid und Oryzalin eine anisotrope Expansion epidermaler Zellen, KAND 11 hingegen nicht.Darüber hinaus führte die gleichzeitige Anwendung von KAND 11 und Disopyramid zu einer kombinierten Disopyramid-induzierten Wurzelwachstumsreaktion und es wurde eine durch KAND 11 induzierte Wachstumshemmung beobachtet (Abb. S4).Wir haben auch die Reaktion der überempfindlichen Mutante Disopyramid 1-1 (phs1-1) auf KAND 11 analysiert. phs1-1 weist eine nicht-kanonische Tubulinkinase-Punktmutation auf und erzeugt bei Behandlung mit Disopyramid kürzere Wurzeln9,20.phs1-1-Mutantensämlinge, die auf Agarmedium mit KAND 11 gewachsen waren, hatten kürzere Wurzeln, ähnlich denen, die auf Disopyramid gewachsen waren (Abb. S5).
Darüber hinaus beobachteten wir mitotische Mikrotubulistrukturen wie Prophasezonen, Spindeln und Phragmoplasten im Wurzelmeristem von mit KAND 11 behandelten Sämlingen. In Übereinstimmung mit den Beobachtungen für CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS war ein signifikanter Rückgang zu verzeichnen Die Anzahl der mitotischen Mikrotubuli wurde beobachtet (Abb. 6c).
Um die Zytotoxizität von KAND 11 bei subzellulärer Auflösung zu charakterisieren, behandelten wir Tabak-BY-2-Suspensionszellen mit KAND 11 und beobachteten ihre Reaktion.Wir haben zunächst KAND 11 zu BY-2-Zellen hinzugefügt, die TagRFP-TUA6 exprimieren, das Mikrotubuli fluoreszierend markiert, um die Wirkung von KAND 11 auf kortikale Mikrotubuli zu beurteilen.Die Dichte der kortikalen Mikrotubuli wurde mithilfe einer Bildanalyse bewertet, die den Prozentsatz der Zytoskelettpixel unter den Zytoplasmapixeln quantifizierte.Die Testergebnisse zeigten, dass nach einstündiger Behandlung mit 50 μM oder 100 μM KAND 11 die Dichte signifikant auf 0,94 ± 0,74 % bzw. 0,23 ± 0,28 % abnahm, während die Dichte der mit DMSO behandelten Zellen 1,61 ± 0,34 betrug % (Abb. 7a).Diese Ergebnisse stimmen mit der Beobachtung bei Arabidopsis überein, dass die Behandlung mit KAND 11 die Depolymerisation kortikaler Mikrotubuli induziert (Abb. 6b).Wir untersuchten auch die BY-2-Linie mit GFP-ABD-markierten Aktinfilamenten nach Behandlung mit der gleichen Konzentration von KAND 11 und beobachteten, dass die Behandlung mit KAND 11 die Aktinfilamente zerstörte.Die einstündige Behandlung mit 50 μM oder 100 μM KAND 11 reduzierte die Aktinfilamentdichte signifikant auf 1,20 ± 0,62 % bzw. 0,61 ± 0,26 %, während die Dichte in DMSO-behandelten Zellen 1,69 ± 0,51 % betrug (Abb. 2).7b).Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu den Wirkungen von Propyzamid, das Aktinfilamente nicht beeinflusst, und Latrunculin B, einem Aktin-Depolymerisator, der Mikrotubuli nicht beeinflusst (SI Abbildung S6).Darüber hinaus hatte die Behandlung mit Coumamonamid 1, Coumamonamidsäure 6 oder KAND 11 keinen Einfluss auf Mikrotubuli in HeLa-Zellen (SI-Abbildung S7).Daher wird angenommen, dass sich der Wirkungsmechanismus von KAND 11 von dem bekannter Zytoskelett-Disruptoren unterscheidet.Darüber hinaus ergab unsere mikroskopische Beobachtung von mit KAND 11 behandelten BY-2-Zellen den Beginn des Zelltods während der Behandlung mit KAND 11 und zeigte, dass der Anteil der mit Evans-Blau gefärbten toten Zellen nach 30-minütiger Behandlung mit KAND 11 nicht signifikant anstieg Nach 90-minütiger Behandlung mit 50 μM bzw. 100 μM KAND stieg die Zahl der toten Zellen auf 43,7 % bzw. 80,1 % (Abb. 7c).Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass es sich bei dem neuartigen Ursolsäure-Derivat KAND 11 um einen pflanzenspezifischen Zytoskelett-Inhibitor mit bisher unbekanntem Wirkmechanismus handelt.
KAND beeinflusst kortikale Mikrotubuli, Aktinfilamente und die Lebensfähigkeit von Tabak-BY-2-Zellen.(a) Visualisierung kortikaler Mikrotubuli in BY-2-Zellen in Gegenwart von TagRFP-TUA6.Mit KAND 11 (50 μM oder 100 μM) oder DMSO behandelte BY-2-Zellen wurden mittels konfokaler Mikroskopie untersucht.Die kortikale Mikrotubulidichte wurde aus mikroskopischen Aufnahmen von 25 unabhängigen Zellen berechnet.Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede hin (Tukey HSD-Test, S< 0,05).Maßstabsbalken = 10 µm.(b) Kortikale Aktinfilamente in BY-2-Zellen, sichtbar gemacht in Gegenwart von GFP-ABD2.Mit KAND 11 (50 μM oder 100 μM) oder DMSO behandelte BY-2-Zellen wurden mittels konfokaler Mikroskopie untersucht.Die Dichte der kortikalen Aktinfilamente wurde aus mikroskopischen Aufnahmen von 25 unabhängigen Zellen berechnet.Buchstaben weisen auf signifikante Unterschiede hin (Tukey HSD-Test, S< 0,05).Maßstabsbalken = 10 µm.(c) Beobachtung toter BY-2-Zellen durch Evans-Blau-Färbung.Mit KAND 11 (50 μM oder 100 μM) oder DMSO behandelte BY-2-Zellen wurden mittels Hellfeldmikroskopie untersucht.n=3.Maßstabsbalken = 100 µm.
Die Entdeckung und Anwendung neuer Naturstoffe hat zu bedeutenden Fortschritten in verschiedenen Bereichen des menschlichen Lebens geführt, darunter in der Medizin und in der Landwirtschaft.Historische Forschungen wurden durchgeführt, um nützliche Verbindungen aus natürlichen Ressourcen zu gewinnen.Insbesondere Actinomyceten sind aufgrund ihrer Fähigkeit, verschiedene Sekundärmetaboliten wie Avermectin, die Hauptverbindung von Ivermectin und Bleomycin und seine Derivate, die medizinisch als Antikrebsmittel eingesetzt werden, zu produzieren, als antiparasitäre Antibiotika für Nematoden nützlich21,22.Ebenso wurden aus Actinomyceten eine Vielzahl herbizider Verbindungen entdeckt, von denen einige bereits kommerziell genutzt werden1,23.Daher gilt die Analyse von Actinomyceten-Metaboliten zur Isolierung von Naturstoffen mit gewünschten biologischen Aktivitäten als wirksame Strategie.In dieser Studie haben wir eine neue Verbindung, Cumamonamid, aus S. werraensis entdeckt und erfolgreich synthetisiert.Ursonsäure ist ein synthetisches Zwischenprodukt von Urbenamid und seinen Derivaten.Es kann eine charakteristische Wurzelkräuselung verursachen, eine mäßige bis starke herbizide Aktivität aufweisen und direkt oder indirekt die Mikrotubuli der Pflanze schädigen.Der Wirkungsmechanismus von Urmotonsäure kann sich jedoch von dem der bestehenden Mikrotubuli-Inhibitoren unterscheiden, da KAND 11 auch Aktinfilamente stört und zum Zelltod führt, was auf einen Regulationsmechanismus hindeutet, durch den Urmotonsäure und ihre Derivate ein breites Spektrum von Zytoskelettstrukturen beeinflussen..
Eine weitere detaillierte Charakterisierung von Urbenonsäure wird dazu beitragen, den Wirkungsmechanismus von Urbenonsäure besser zu verstehen.Das nächste Ziel besteht insbesondere darin, die Fähigkeit von Ursonsäure zu bewerten, an reduzierte Mikrotubuli zu binden, um festzustellen, ob Ursonsäure und ihre Derivate direkt auf Mikrotubuli wirken und diese depolymerisieren, oder ob ihre Wirkung zu einer Destabilisierung der Mikrotubuli führt.Wenn Mikrotubuli kein direktes Ziel sind, hilft die Identifizierung des Wirkungsorts und der molekularen Ziele von Ursonsäure auf Pflanzenzellen außerdem dabei, die Eigenschaften verwandter Verbindungen und mögliche Wege zur Verbesserung der herbiziden Aktivität besser zu verstehen.Unser Bioaktivitätstest zeigte die einzigartige zytotoxische Wirkung von Ursonsäure auf das Wachstum von Pflanzen wie Arabidopsis thaliana, Tabak und Leberblümchen, während weder E. coli noch HeLa-Zellen betroffen waren.Ein Vorteil von Ursonsäurederivaten ist die geringe oder keine Toxizität für tierische Zellen, wenn sie als Herbizide für den Einsatz auf offenen landwirtschaftlichen Feldern entwickelt werden.Da es sich bei Mikrotubuli um häufig vorkommende Strukturen in Eukaryoten handelt, ist ihre selektive Hemmung in Pflanzen eine Schlüsselvoraussetzung für Herbizide.Beispielsweise wird Propyzamid, ein Mikrotubuli-depolymerisierendes Mittel, das direkt an Tubulin bindet und die Polymerisation hemmt, aufgrund seiner geringen Toxizität für tierische Zellen als Herbizid verwendet24.Im Gegensatz zu Disopyramid weisen verwandte Benzamide unterschiedliche Zielspezifitäten auf.Neben pflanzlichen Mikrotubuli hemmen RH-4032 oder Benzoxamid auch Mikrotubuli tierischer Zellen bzw. Oomyceten, und Zalilamid wird aufgrund seiner geringen Phytotoxizität als Fungizid eingesetzt25,26,27.Der neu entdeckte Bär und seine Derivate weisen eine selektive Zytotoxizität gegenüber Pflanzen auf. Es ist jedoch zu beachten, dass weitere Modifikationen ihre Zielspezifität verändern und möglicherweise zusätzliche Derivate für die Bekämpfung pathogener Pilze oder Oomyceten liefern könnten.
Die einzigartigen Eigenschaften von Urbenonsäure und ihren Derivaten sind für ihre Entwicklung als Herbizide und den Einsatz als Forschungsinstrumente nützlich.Die Bedeutung des Zytoskeletts für die Steuerung der Zellform von Pflanzen ist allgemein anerkannt.Frühere Studien haben gezeigt, dass Pflanzen komplexe Mechanismen der kortikalen Mikrotubuli-Organisation entwickelt haben, indem sie die Mikrotubuli-Dynamik steuern, um die Morphogenese richtig zu steuern.Es wurde eine große Anzahl von Molekülen identifiziert, die für die Regulierung der Mikrotubuli-Aktivität verantwortlich sind, und die entsprechende Forschung ist noch im Gange3,4,28.Unser derzeitiges Verständnis der Mikrotubuli-Dynamik in Pflanzenzellen erklärt die Mechanismen der kortikalen Mikrotubuli-Organisation nicht vollständig.Obwohl beispielsweise sowohl Disopyramid als auch Oryzalin Mikrotubuli depolymerisieren können, verursacht Disopyramid eine schwere Wurzelverzerrung, während Oryzalin eine relativ milde Wirkung hat.Darüber hinaus verursachen Mutationen in Tubulin, das die Mikrotubuli stabilisiert, auch eine Rechtsdrehung in den Wurzeln, wohingegen Paclitaxel, das ebenfalls die Dynamik der Mikrotubuli stabilisiert, dies nicht tut.Daher sollte die Untersuchung und Identifizierung der molekularen Ziele von Ursolsäure neue Einblicke in die Regulierung pflanzlicher kortikaler Mikrotubuli liefern.Ebenso werden künftige Vergleiche von Chemikalien, die wirksam bei der Förderung von verzerrtem Wachstum sind, wie Disopyramid, und weniger wirksamen Chemikalien, wie etwa Oryzalin oder Kumamotorsäure, Hinweise darauf liefern, wie es zu verzerrtem Wachstum kommt.
Andererseits sind verteidigungsbedingte Veränderungen des Zytoskeletts eine weitere Möglichkeit, die Zytotoxizität von Ursonsäure zu erklären.Eine Infektion mit einem Krankheitserreger oder die Einführung eines Auslösers in Pflanzenzellen führt manchmal zur Zerstörung des Zytoskeletts und anschließend zum Zelltod29.Beispielsweise wurde berichtet, dass aus Oomyceten gewonnenes Cryptoxanthin Mikrotubuli und Aktinfilamente zerstört, bevor Tabakzellen absterben, ähnlich wie es bei der KAND-Behandlung der Fall ist30,31.Die Ähnlichkeiten zwischen Abwehrreaktionen und zellulären Reaktionen, die durch Ursonsäure hervorgerufen werden, führten uns zu der Hypothese, dass sie gemeinsame zelluläre Prozesse auslösen, obwohl eine schnellere und stärkere Wirkung von Ursonsäure als Cryptoxanthin offensichtlich ist.Studien haben jedoch gezeigt, dass eine Störung der Aktinfilamente den spontanen Zelltod fördert, der nicht immer mit einer Störung der Mikrotubuli einhergeht29.Darüber hinaus bleibt abzuwarten, ob entweder der Erreger oder der Auslöser ein verzerrtes Wurzelwachstum verursacht, wie es bei Ursonsäurederivaten der Fall ist.Daher ist das molekulare Wissen über die Verknüpfung von Abwehrreaktionen und dem Zytoskelett ein attraktives Problem, das angegangen werden muss.Indem sie das Vorhandensein von mit Ursonsäure verwandten Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht sowie einer Reihe von Derivaten mit unterschiedlichen Wirksamkeiten ausnutzen, könnten sie Möglichkeiten bieten, auf unbekannte zelluläre Mechanismen abzuzielen.
Insgesamt wird die Entdeckung und Anwendung neuer Verbindungen, die die Mikrotubuli-Dynamik modulieren, leistungsstarke Methoden zur Behandlung der komplexen molekularen Mechanismen liefern, die der Bestimmung der Pflanzenzellform zugrunde liegen.In diesem Zusammenhang könnte die kürzlich entwickelte Verbindung Urmotonsäure, die Mikrotubuli und Aktinfilamente beeinflusst und den Zelltod induziert, eine Gelegenheit bieten, den Zusammenhang zwischen der Mikrotubuli-Kontrolle und diesen anderen Mechanismen zu entschlüsseln.Daher werden chemische und biologische Analysen mit Urbenonsäure uns helfen, die molekularen Regulationsmechanismen zu verstehen, die das pflanzliche Zytoskelett steuern.
S. werraensis MK493-CF1 in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben mit Schikanen beimpfen, der 110 ml Anzuchtmedium enthält, bestehend aus 2 % (w/v) Galactose, 2 % (w/v) Essence Paste, 1 % (w/v) Bacto-Zusammensetzung .-Sojaton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5 % (w/v) Maisextrakt (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0,2 % (w/v) (NH4)2SO4 und 0,2 % CaCO3 in entionisiertem Wasser.(pH 7,4 vor der Sterilisation).Die Impfkulturen wurden auf einem Rotationsschüttler (180 U/min) 2 Tage lang bei 27 °C inkubiert.Produktionsanbau mittels Festphasenfermentation.Die Impfkultur (7 ml) wurde in einen 500-ml-K-1-Kolben überführt, der 40 g Produktionsmedium enthielt, bestehend aus 15 g gepresster Gerste (MUSO Co., Ltd., Japan) und 25 g entionisiertem Wasser (pH-Wert nicht angepasst). vor der Sterilisation).).Die Fermentation erfolgte 14 Tage lang im Dunkeln bei 30°C.Das Fermentationsmaterial wurde mit 40 ml/Flasche EtOH extrahiert und zentrifugiert (1500 g, 4°C, 10 Min.).Der Kulturüberstand (60 ml) wurde mit einer Mischung aus 10 % MeOH/EtOAc extrahiert.Die organische Schicht wurde unter reduziertem Druck eingedampft, um einen Rückstand (59,5 mg) zu erhalten, der einer HPLC mit Gradientenelution (0–10 Minuten: 90 %) auf einer Umkehrphasensäule (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × Länge 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 Minuten: 90 % H2O/CH3CN bis 70 % H2O/CH3CN (Gradient), 35–45 Minuten: 90 % H2O/EtOH, 45–155 Minuten: 90 % H2O /EtOH auf 100 % EtOH (Gradient (Gradient), 155–200 min: 100 % EtOH) bei einer Flussrate von 1,5 ml/min wurde Cumamonamid (1, 36,0 mg) als weißes amorphes Pulver isoliert.
Kumamotoamid(1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H).), 4,08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ berechneter Wert: 141,0659, gemessener Wert: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Columbia-Samen (Col-0) wurden vom Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) mit Genehmigung für Forschungszwecke bezogen.Col-0-Samen wurden unter unseren Laborbedingungen vermehrt und gehalten und als Wildtyp-Arabidopsis-Pflanzen verwendet.Arabidopsis-Samen wurden oberflächensterilisiert und in halbstarkem Murashige- und Skoog-Medium mit 2 % Saccharose (Fujifilm Wako Pure Chemical) und 0,05 % (Gew./Vol.) 2-(4-Morpholino)ethansulfonsäure (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) kultiviert ).) und 1,5 % Agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, bei 23 °C und konstantem Licht.Samen der phs1-1-Mutante wurden von T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) bereitgestellt.
Samen des Stammes SR-1 wurden von T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) bereitgestellt und als Wildtyp-Tabakpflanzen verwendet.Tabaksamen wurden oberflächensterilisiert und drei Nächte lang in sterilem Wasser eingeweicht, um die Keimung zu fördern. Anschließend wurden sie in eine halbkonzentrierte Lösung gegeben, die 2 % Saccharose, 0,05 % (Gew./Vol.) MES und 0,8 % Gellangummi (Fujifilm Wako Pure Chemical) enthielt. Murashige.und Skoog-Medium) mit pH 5,7 und bei 23°C unter konstantem Licht inkubiert.
Der Stamm Tak-1 wurde von T. Kohchi (Universität Kyoto) bereitgestellt und als Standard-Versuchseinheit für die Lebermoos-Studie verwendet.Gemma wurde aus sterilisierten Kulturpflanzen gewonnen und dann auf Gamborg B5-Medium (Fujifilm Wako Pure Chemical) mit 1 % Saccharose und 0,3 % Gellangummi ausplattiert und bei 23 °C unter kontinuierlichem Licht inkubiert.
Tabak-BY-2-Zellen (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) wurden von S. Hasezawa (Universität Tokio) bereitgestellt.BY-2-Zellen wurden 95-fach in modifiziertem Linsmeier- und Skoog-Medium verdünnt und wöchentlich mit 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure 32 ergänzt.Die Zellsuspension wurde auf einem Rotationsschüttler bei 130 U/min bei 27 °C im Dunkeln gemischt.Waschen Sie die Zellen mit dem 10-fachen Volumen an frischem Medium und suspendieren Sie sie im gleichen Medium.Transgene BY-2-Zelllinien, die den Mikrotubuli-Marker TagRFP-TUA6 oder den Aktinfilament-Marker GFP-ABD2 unter dem 35S-Promotor des Blumenkohlmosaikvirus stabil exprimieren, wurden wie beschrieben generiert33,34,35.Diese Zelllinien können mit ähnlichen Verfahren wie die ursprüngliche BY-2-Zelllinie gepflegt und synchronisiert werden.
HeLa-Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) (Life Technologies), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum, 1,2 U/ml Penicillin und 1,2 μg/ml Streptomycin, in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 kultiviert.
Alle in diesem Manuskript beschriebenen Experimente wurden in Übereinstimmung mit den japanischen Vorschriften und Richtlinien zur biologischen Sicherheit durchgeführt.
Die Verbindungen wurden in Dimethylsulfoxid (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) als Stammlösungen gelöst und in MS-Medium für Arabidopsis und Tabak oder Gamborg B5-Medium für Leberblümchen verdünnt.Für den Wurzelwachstumshemmtest wurden mehr als 10 Samen pro Platte auf Agarmedium ausgesät, das die angegebenen Verbindungen oder DMSO enthielt.Die Samen wurden 7 Tage lang in einer Wachstumskammer inkubiert.Die Sämlinge wurden fotografiert und die Länge der Wurzeln gemessen.Für den Arabidopsis-Keimungstest wurden 48 Samen pro Platte auf Agarmedium mit 200 μM Verbindung oder DMSO ausgesät.Arabidopsis-Samen wurden in einer Wachstumskammer gezüchtet und die Anzahl der gekeimten Sämlinge wurde 7 Tage nach der Keimung (dag) gezählt.Für den Tabakkeimtest wurden 24 Samen pro Platte auf Agarmedium mit 200 μM KAND oder DMSO ausgesät.Tabaksamen wurden in einer Wachstumskammer gezüchtet und die Anzahl der gekeimten Sämlinge wurde nach 14 Tagen gezählt.Für den Leberblümchen-Wachstumshemmtest wurden 9 Embryonen von jeder Platte auf Agarmedium mit den angegebenen Konzentrationen an KAND oder DMSO ausplattiert und 14 Tage lang in einer Wachstumskammer inkubiert.
Verwenden Sie Sämlinge, die mit 5 mg/ml Propidiumiodid (PI) gefärbt sind, um die Organisation des Wurzelmeristems zu visualisieren.PI-Signale wurden durch Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung eines konfokalen TCS SPE-Laser-Scanning-Mikroskops (Leica Microsystems) beobachtet.
Die histochemische Färbung der Wurzeln mit β-Glucuronidase (GUS) wurde gemäß dem von Malami und Benfey36 beschriebenen Protokoll durchgeführt.Sämlinge wurden über Nacht in 90 % Aceton fixiert, 1 Stunde lang mit 0,5 mg/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-d-glucuronsäure in GUS-Puffer gefärbt und in eine hydratisierte Chloraldehydlösung gegeben.(8 g Chloralhydrat, 2 ml Wasser und 1 ml Glycerin) und durch Differential-Interferenz-Kontrastmikroskopie unter Verwendung eines Axio Imager M1-Mikroskops (Carl Zeiss) beobachtet.
Die Wurzelwinkel wurden an 7 Tage alten Sämlingen gemessen, die auf vertikal angeordneten Platten gewachsen waren.Messen Sie den Winkel der Wurzel aus der Richtung des Schwerkraftvektors, wie in Schritt 6 beschrieben.
Die Anordnung der kortikalen Mikrotubuli wurde wie beschrieben beobachtet, mit geringfügigen Änderungen am Protokoll 37 .Anti-β-Tubulin-Antikörper (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) und Alexa Fluor 488-konjugiertes Anti-Maus-IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) wurden als primäre und sekundäre Antikörper in Verdünnungen von 1:1000 und 1:100 verwendet. jeweils.Fluoreszenzbilder wurden mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop TCS SPE (Leica Microsystems) aufgenommen.Erfassen Sie Z-Stapelbilder und erstellen Sie Projektionen mit maximaler Intensität gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Der HeLa-Zellproliferationstest wurde mit dem Cell Counting Kit 8 (Dojindo) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
Das Wachstum von E. coli DH5α wurde durch Messung der Zelldichte in Kultur mit einem Spektrophotometer bei 600 nm (OD600) analysiert.
Die Organisation des Zytoskeletts in transgenen BY-2-Zellen wurde mit einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet, das mit einem konfokalen Scangerät CSU-X1 (Yokogawa) und einer sCMOS-Kamera (Zyla, Andor Technology) ausgestattet war.Die Zytoskelettdichte wurde durch Bildanalyse bewertet, die den Prozentsatz der Zytoskelettpixel unter den zytoplasmatischen Pixeln in konfokalen Bildern mithilfe der ImageJ-Software wie beschrieben quantifizierte38,39.
Um den Zelltod in BY-2-Zellen nachzuweisen, wurde ein Aliquot der Zellsuspension mit 0,05 % Evans-Blau 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert.Die selektive Evans-Blau-Färbung toter Zellen hängt von der Extrusion des Farbstoffs aus lebensfähigen Zellen durch die intakte Plasmamembran ab40.Die gefärbten Zellen wurden unter Verwendung eines Hellfeldmikroskops (BX53, Olympus) beobachtet.
HeLa-Zellen wurden in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 gezüchtet.Die Zellen wurden 6 Stunden lang bei 37 °C mit 100 μM KAND 11, Kumamonamidsäure 6, Kumamonamid 1, 100 ng/ml Colcemid (Gibco) oder 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) behandelt.Die Zellen wurden 10 Minuten lang mit MetOH und dann 5 Minuten lang mit Acetat bei Raumtemperatur fixiert.Fixierte Zellen wurden mit β-Tubulin-Primärantikörper (1D4A4, Proteintech: 66240-1), verdünnt in 0,5 % BSA/PBS, 2 Stunden lang inkubiert, dreimal mit TBST gewaschen und dann mit Alexa Fluor-Ziegenantikörper inkubiert.488 1 Stunde.– Maus-IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) und 15 ng/ml 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), verdünnt in 0,5 % BSA/PBS.Nach dreimaligem Waschen mit TBST wurden die gefärbten Zellen auf einem inversen Nikon Eclipse Ti-E-Mikroskop beobachtet.Die Bilder wurden mit einer gekühlten Hamamatsu ORCA-R2 CCD-Kamera unter Verwendung der MetaMorph-Software (Molecular Devices) aufgenommen.
Zeitpunkt der Veröffentlichung: 17. Juni 2024