Der Kiefernnematode ist ein wandernder Quarantäne-Endoparasit, der bekanntermaßen schwere wirtschaftliche Verluste in Kiefernwald-Ökosystemen verursacht. Die vorliegende Studie untersucht die nematizide Aktivität halogenierter Indole gegen Kiefernnematoden und ihren Wirkungsmechanismus. Die nematizide Aktivität von 5-Iodoindol und Avermectin (positive Kontrolle) gegen Kiefernnematoden war bei niedrigen Konzentrationen (10 μg/ml) ähnlich und hoch. 5-Iodoindol verringerte Fruchtbarkeit, Reproduktionsaktivität, Embryonen- und Larvensterblichkeit sowie das Bewegungsverhalten. Molekulare Wechselwirkungen von Liganden mit wirbellosenspezifischen Glutamat-gesteuerten Chloridkanalrezeptoren stützen die Annahme, dass 5-Iodoindol, wie Avermectin, fest an das aktive Zentrum des Rezeptors bindet. 5-Iodoindol induzierte außerdem verschiedene phänotypische Deformationen bei Nematoden, darunter abnormalen Organkollaps/-schrumpfung und verstärkte Vakuolisierung. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Vakuolen beim durch Methylierung vermittelten Tod von Nematoden eine Rolle spielen könnten. Wichtig ist, dass 5-Iodoindol für beide Pflanzenarten (Kohl und Rettich) ungiftig war. Somit zeigt diese Studie, dass die Anwendung von Iodoindol unter Umweltbedingungen die Kiefernwelke eindämmen kann.
Der Kiefernholznematode (Bursaphelenchus xylophilus) gehört zu den Kiefernholznematoden (PWN), wandernden endoparasitären Fadenwürmern, die bekanntermaßen schwere ökologische Schäden in Kiefernwald-Ökosystemen verursachen1. Die durch den Kiefernholznematoden verursachte Kiefernwelke (PWD) wird auf mehreren Kontinenten, darunter Asien und Europa, zu einem ernsten Problem, und in Nordamerika vernichtet der Fadenwurm eingeführte Kiefernarten1,2. Das Kiefernsterben ist ein großes wirtschaftliches Problem und die Aussicht auf seine weltweite Ausbreitung ist besorgniserregend3. Die folgenden Kiefernarten werden am häufigsten von dem Fadenwurm befallen: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii und Pinus radiata4. Der Kiefernnematode ist eine ernste Krankheit, die Kiefern innerhalb von Wochen oder Monaten nach der Infektion töten kann. Darüber hinaus kommt es in zahlreichen Ökosystemen häufig zu Ausbrüchen des Kiefernnematoden, sodass sich anhaltende Infektionsketten gebildet haben1.
Bursaphelenchus xylophilus ist ein pflanzenparasitärer Quarantänenematode aus der Überfamilie Aphelenchoidea und Klade 102.5. Der Nematode ernährt sich von Pilzen und vermehrt sich im Holzgewebe von Kiefern. Dabei entwickelt er sich zu vier verschiedenen Larvenstadien: L1, L2, L3, L4 und einem adulten Individuum1,6. Bei Nahrungsknappheit entwickelt sich der Kiefernnematode zu einem spezialisierten Larvenstadium – der Dauer, in dem er seinen Vektor – den Borkenkäfer (Monochamus alternatus) – parasitiert und auf gesunde Kiefern übertragen wird. In gesunden Wirten wandern die Nematoden schnell durch das Pflanzengewebe und ernähren sich von Parenchymzellen, was innerhalb eines Jahres nach der Infektion zu einer Reihe von Überempfindlichkeitsreaktionen, Kiefernwelke und Tod führt1,7,8.
Die biologische Bekämpfung von Kiefernnematoden ist seit langem eine Herausforderung, wobei Quarantänemaßnahmen bis ins 20. Jahrhundert zurückreichen. Aktuelle Strategien zur Bekämpfung von Kiefernnematoden umfassen hauptsächlich chemische Behandlungen, darunter Holzbegasung und die Implantation von Nematiziden in Baumstämme. Die am häufigsten verwendeten Nematizide sind Avermectin und Avermectinbenzoat, die zur Avermectin-Familie gehören. Diese teuren Chemikalien sind hochwirksam gegen viele Nematodenarten und gelten als umweltverträglich9. Es ist jedoch zu erwarten, dass die wiederholte Verwendung dieser Nematizide einen Selektionsdruck erzeugt, der mit ziemlicher Sicherheit zur Entstehung resistenter Kiefernnematoden führt, wie für mehrere Schadinsekten wie Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella und die Nematoden Trichostrongylus colubriformis und Ostertagia circumcincta nachgewiesen wurde, die allmählich eine Resistenz gegen Avermectine entwickelt haben10,11,12. Daher müssen Resistenzmuster regelmäßig untersucht und Nematizide kontinuierlich geprüft werden, um alternative, kostengünstige und umweltfreundliche Maßnahmen zur Kontrolle der PVD zu finden. In den letzten Jahrzehnten haben zahlreiche Autoren die Verwendung von Pflanzenextrakten, ätherischen Ölen und flüchtigen Stoffen als Mittel zur Nematodenbekämpfung vorgeschlagen13,14,15,16.
Wir haben vor Kurzem die nematizide Aktivität von Indol, einem interzellulären und bakterienreichen Signalmolekül, in Caenorhabditis elegans nachgewiesen 17 . Indol ist ein weit verbreitetes intrazelluläres Signal in der mikrobiellen Ökologie, das zahlreiche Funktionen steuert, die die mikrobielle Physiologie, Sporenbildung, Plasmid-Stabilität, Arzneimittelresistenz, Biofilmbildung und Virulenz beeinflussen 18, 19 . Die Aktivität von Indol und seinen Derivaten gegen andere pathogene Nematoden wurde nicht untersucht. In dieser Studie untersuchten wir die nematizide Aktivität von 34 Indolen gegen Kiefernnematoden und erläuterten den Wirkungsmechanismus des wirksamsten 5-Iodoindols mithilfe von Mikroskopie, Zeitrafferfotografie und molekularen Docking-Experimenten. Außerdem bewerteten wir seine toxischen Auswirkungen auf Pflanzen mithilfe eines Samenkeimungstests.
Es wurde bereits berichtet, dass hohe Konzentrationen (>1,0 mM) Indol eine nematizide Wirkung auf Nematoden haben17. Nach der Behandlung von B. xylophilus (gemischte Lebensstadien) mit Indol oder 33 verschiedenen Indolderivaten bei 1 mM wurde die Mortalität von B. xylophilus durch Zählen lebender und toter Nematoden in der Kontrollgruppe und der behandelten Gruppe gemessen. Fünf Indole zeigten eine signifikante nematizide Aktivität; die Überlebensrate der unbehandelten Kontrollgruppe lag nach 24 Stunden bei 95 ± 7 %. Von den 34 getesteten Indolen verursachten 5-Iodindol und 4-Fluorindol bei 1 mM eine Mortalität von 100 %, während 5,6-Difluorindigo, Methylindol-7-carboxylat und 7-Iodindol eine Mortalität von etwa 50 % verursachten (Tabelle 1).
Wirkung von 5-Iodoindol auf die Vakuolenbildung und den Stoffwechsel des Kiefernfadenwurms. (A) Wirkung von Avermectin und 5-Iodoindol auf adulte männliche Fadenwürmer, (B) Eier im L1-Stadium und (C) Stoffwechsel von B. xylophilus. (i) Nach 0 Stunden wurden keine Vakuolen beobachtet. Die Behandlung führte zu (ii) Vakuolen, (iii) Ansammlung multipler Vakuolen, (iv) Schwellung der Vakuolen, (v) Verschmelzung der Vakuolen und (vi) Bildung von Riesenvakuolen. Rote Pfeile zeigen Schwellung der Vakuolen an, blaue Pfeile Verschmelzung der Vakuolen und schwarze Pfeile Riesenvakuolen. Maßstab = 50 μm.
Zudem beschrieb diese Studie den sequentiellen Prozess des durch Methan verursachten Zelltods bei Kiefernnematoden (Abbildung 4C). Der methanogene Zelltod ist eine nicht-apoptotische Art des Zelltods, die mit der Ansammlung auffälliger zytoplasmatischer Vakuolen einhergeht27. Die bei Kiefernnematoden beobachteten morphologischen Defekte scheinen eng mit dem Mechanismus des durch Methan verursachten Zelltods zusammenzuhängen. Mikroskopische Untersuchungen zu verschiedenen Zeitpunkten zeigten, dass sich nach 20-stündiger Einwirkung von 5-Iodoindol (0,1 mM) Riesenvakuolen bildeten. Nach 8-stündiger Behandlung wurden mikroskopische Vakuolen beobachtet, und ihre Zahl nahm nach 12 Stunden zu. Nach 14 Stunden wurden mehrere große Vakuolen beobachtet. Nach 12–16 Stunden Behandlung waren mehrere verschmolzene Vakuolen deutlich sichtbar, was darauf hindeutet, dass die Vakuolenfusion die Grundlage des methanogenen Todesmechanismus ist. Nach 20 Stunden wurden im gesamten Wurm mehrere Riesenvakuolen gefunden. Diese Beobachtungen stellen den ersten Bericht über Metuose bei C. elegans dar.
Bei mit 5-Iodoindol behandelten Würmern wurden zudem Vakuolenaggregation und -ruptur beobachtet (Abb. 5), was sich in der Wurmbiegung und der Vakuolenfreisetzung in die Umwelt zeigte. Auch in der Eierschalenmembran, die normalerweise während des Schlüpfens von L2 intakt gehalten wird, wurde eine Vakuolenruptur beobachtet (Ergänzende Abb. S2). Diese Beobachtungen stützen die Beteiligung von Flüssigkeitsansammlungen und osmoregulatorischen Störungen sowie reversibler Zellschädigung (RCI) am Prozess der Vakuolenbildung und -eiterung (Abb. 5).
Wir stellten eine Hypothese zur Rolle von Jod bei der beobachteten Vakuolenbildung auf und untersuchten die nematizide Aktivität von Natriumjodid (NaI) und Kaliumjodid (KI). In Konzentrationen (0,1, 0,5 oder 1 mM) hatten sie jedoch weder einen Einfluss auf das Überleben der Nematoden noch auf die Vakuolenbildung (Ergänzende Abb. S5), obwohl 1 mM KI eine leichte nematizide Wirkung hatte. Andererseits induzierte 7-Iodoindol (1 oder 2 mM) ebenso wie 5-Iodoindol mehrere Vakuolen und strukturelle Deformationen (Ergänzende Abb. S6). Die beiden Iodoindole zeigten ähnliche phänotypische Merkmale in Kiefernnematoden, NaI und KI hingegen nicht. Interessanterweise induzierte Indol in den getesteten Konzentrationen keine Vakuolenbildung in B. xylophilus (Daten nicht gezeigt). Somit bestätigten die Ergebnisse, dass der Indol-Jod-Komplex für die Vakuolisierung und den Stoffwechsel von B. xylophilus verantwortlich ist.
Unter den auf nematizide Aktivität getesteten Indolen hatte 5-Iodindol den höchsten Slip-Index von -5,89 kcal/mol, gefolgt von 7-Iodindol (-4,48 kcal/mol), 4-Fluorindol (-4,33) und Indol (-4,03) (Abbildung 6). Die starke Wasserstoffbrückenbindung im Rückgrat von 5-Iodindol an Leucin 218 stabilisiert seine Bindung, während alle anderen Indolderivate über Wasserstoffbrückenbindungen in der Seitenkette an Serin 260 binden. Unter anderen modellierten Iodoindolen hat 2-Iodoindol einen Bindungswert von -5,248 kcal/mol, was auf seine Hauptwasserstoffbrücke mit Leucin 218 zurückzuführen ist. Andere bekannte Bindungen umfassen 3-Iodoindol (-4,3 kcal/mol), 4-Iodoindol (-4,0 kcal/mol) und 6-Fluorindol (-2,6 kcal/mol) (Ergänzende Abbildung S8). Die meisten halogenierten Indole und Indol selbst, mit Ausnahme von 5-Iodoindol und 2-Iodoindol, bilden eine Bindung mit Serin 260. Die Tatsache, dass Wasserstoffbrücken mit Leucin 218 auf eine effiziente Rezeptor-Liganden-Bindung hinweisen, wie sie bei Ivermectin beobachtet wurde (Ergänzende Abb. S7), bestätigt, dass 5-Iodoindol und 2-Iodoindol, wie Ivermectin, über Leucin 218 fest an das aktive Zentrum des GluCL-Rezeptors binden (Abb. 6 und Ergänzende Abb. S8). Wir gehen davon aus, dass diese Bindung erforderlich ist, um die offene Porenstruktur des GluCL-Komplexes aufrechtzuerhalten, und dass 5-Iodoindol, 2-Iodoindol, Avermectin und Ivermectin durch die feste Bindung an das aktive Zentrum des GluCL-Rezeptors den Ionenkanal offen halten und die Flüssigkeitsaufnahme ermöglichen.
Molekulares Andocken von Indol und halogeniertem Indol an GluCL. Bindungsorientierungen von (A) Indol-, (B) 4-Fluorindol-, (C) 7-Iodindol- und (D) 5-Iodindol-Liganden an das aktive Zentrum von GluCL. Das Protein wird durch ein Band dargestellt, die Wasserstoffbrückenbindungen im Proteinrückgrat sind als gelb gepunktete Linien dargestellt. (A′), (B′), (C′) und (D′) zeigen die Wechselwirkungen der entsprechenden Liganden mit den umgebenden Aminosäureresten, die Wasserstoffbrückenbindungen in den Seitenketten sind durch rosa gepunktete Pfeile gekennzeichnet.
Es wurden Experimente durchgeführt, um die toxische Wirkung von 5-Iodoindol auf die Keimung von Kohl- und Rettichsamen zu untersuchen. 5-Iodoindol (0,05 oder 0,1 mM) oder Avermectin (10 μg/ml) hatten wenig oder keine Wirkung auf die anfängliche Keimung und das Auflaufen der Pflänzchen (Abbildung 7). Darüber hinaus wurde kein signifikanter Unterschied zwischen der Keimrate unbehandelter Kontrollgruppen und mit 5-Iodoindol oder Avermectin behandelter Samen festgestellt. Die Wirkung auf das Wachstum der Pfahlwurzel und die Anzahl der gebildeten Seitenwurzeln war unbedeutend, obwohl 1 mM (das Zehnfache der aktiven Konzentration) 5-Iodoindol die Entwicklung der Seitenwurzeln leicht verzögerte. Diese Ergebnisse zeigen, dass 5-Iodoindol für Pflanzenzellen ungiftig ist und in den untersuchten Konzentrationen die Pflanzenentwicklungsprozesse nicht stört.
Einfluss von 5-Iodoindol auf die Samenkeimung. Keimung, Sprießen und seitliche Wurzelbildung von B. oleracea- und R. raphanistrum-Samen auf Murashige- und Skoog-Agarmedium mit oder ohne Avermectin oder 5-Iodoindol. Die Keimung wurde nach 3 Tagen Inkubation bei 22 °C aufgezeichnet.
Diese Studie berichtet über mehrere Fälle, in denen Indole Nematoden abtöteten. Wichtig ist, dass dies der erste Bericht über die Methylierung von Kiefernnadeln durch Iodoindol ist (ein Prozess, der durch die Ansammlung kleiner Vakuolen entsteht, die sich allmählich zu riesigen Vakuolen zusammenschließen und schließlich zum Membranbruch und zum Tod führen). Iodoindol weist dabei signifikante nematizide Eigenschaften auf, die denen des kommerziellen Nematizids Avermectin ähneln.
Es wurde bereits berichtet, dass Indole in Prokaryoten und Eukaryoten mehrere Signalfunktionen ausüben, darunter Biofilmhemmung/-bildung, bakterielles Überleben und Pathogenität19,32,33,34. In jüngster Zeit haben die potenziellen therapeutischen Wirkungen von halogenierten Indolen, Indolalkaloiden und halbsynthetischen Indolderivaten großes Forschungsinteresse geweckt35,36,37. Beispielsweise wurde gezeigt, dass halogenierte Indole persistente Escherichia coli- und Staphylococcus aureus-Zellen abtöten37. Darüber hinaus ist es von wissenschaftlichem Interesse, die Wirksamkeit halogenierter Indole gegen andere Arten, Gattungen und Reiche zu untersuchen, und diese Studie ist ein Schritt in diese Richtung.
Hier schlagen wir einen Mechanismus für die durch 5-Iodoindol induzierte Letalität in C. elegans vor, der auf reversibler Zellschädigung (RCI) und Methylierung basiert (Abbildungen 4C und 5). Ödematöse Veränderungen wie Schwellungen und Vakuolendegeneration sind Indikatoren für RCI und Methylierung und manifestieren sich als Riesenvakuolen im Zytoplasma48,49. RCI stört die Energieproduktion, indem es die ATP-Produktion reduziert, was zum Versagen der ATPase-Pumpe führt oder Zellmembranen zerstört und einen schnellen Einstrom von Na+, Ca2+ und Wasser verursacht50,51,52. Intrazytoplasmatische Vakuolen entstehen in tierischen Zellen durch Flüssigkeitsansammlung im Zytoplasma aufgrund des Einstroms von Ca2+ und Wasser53. Interessanterweise ist dieser Mechanismus der Zellschädigung reversibel, wenn der Schaden vorübergehend ist und die Zellen für eine gewisse Zeit mit der ATP-Produktion beginnen. Wenn der Schaden jedoch anhält oder sich verschlimmert, sterben die Zellen ab.54 Unsere Beobachtungen zeigen, dass mit 5-Iodoindol behandelte Nematoden nach Belastung mit Stressbedingungen nicht in der Lage sind, die normale Biosynthese wiederherzustellen.
Der durch 5-Iodoindol in B. xylophilus induzierte Methylierungsphänotyp könnte auf das Vorhandensein von Iod und seine molekulare Verteilung zurückzuführen sein, da 7-Iodoindol eine weniger hemmende Wirkung auf B. xylophilus hatte als 5-Iodoindol (Tabelle 1 und ergänzende Abbildung S6). Diese Ergebnisse stimmen teilweise mit den Studien von Maltese et al. (2014) überein, die berichteten, dass die Translokation des Pyridylstickstoffrests in Indol von der Para- in die Metaposition die Vakuolisierung, Wachstumshemmung und Zytotoxizität in U251-Zellen aufhob, was darauf hindeutet, dass die Interaktion des Moleküls mit einem spezifischen aktiven Zentrum im Protein entscheidend ist27,44,45. Die in dieser Studie beobachteten Wechselwirkungen zwischen Indol oder halogenierten Indolen und GluCL-Rezeptoren stützen diese Annahme ebenfalls, da 5- und 2-Iodindol stärker an GluCL-Rezeptoren binden als die anderen untersuchten Indole (Abbildung 6 und ergänzende Abbildung S8). Das Iod an der zweiten oder fünften Position des Indols bindet über Wasserstoffbrücken im Rückgrat an Leucin 218 des GluCL-Rezeptors, während andere halogenierte Indole und Indol selbst schwache Wasserstoffbrücken in der Seitenkette mit Serin 260 bilden (Abbildung 6). Wir spekulieren daher, dass die Lokalisierung des Halogens eine wichtige Rolle bei der Induktion der Vakuolendegeneration spielt, während die feste Bindung von 5-Iodindol den Ionenkanal offen hält und dadurch einen schnellen Flüssigkeitseinstrom und ein Platzen der Vakuole ermöglicht. Der genaue Wirkungsmechanismus von 5-Iodindol muss jedoch noch bestimmt werden.
Vor der praktischen Anwendung von 5-Iodoindol sollte seine toxische Wirkung auf Pflanzen analysiert werden. Unsere Keimungsexperimente zeigten, dass 5-Iodoindol in den untersuchten Konzentrationen keine negativen Auswirkungen auf die Keimung oder nachfolgende Entwicklungsprozesse hatte (Abbildung 7). Somit liefert diese Studie eine Grundlage für den Einsatz von 5-Iodoindol im ökologischen Umfeld zur Eindämmung der Schädlichkeit von Kiefernnematoden für Kiefern.
Frühere Berichte haben gezeigt, dass eine Indol-basierte Therapie einen potenziellen Ansatz zur Lösung des Problems der Antibiotikaresistenz und der Krebsprogression darstellt55. Darüber hinaus wirken Indole antibakteriell, krebshemmend, antioxidativ, entzündungshemmend, antidiabetisch, antiviral, antiproliferativ und tuberkulosehemmend und könnten eine vielversprechende Grundlage für die Arzneimittelentwicklung darstellen56,57. Diese Studie legt erstmals die potenzielle Verwendung von Jod als antiparasitäres und anthelminthisches Mittel nahe.
Avermectin wurde vor drei Jahrzehnten entdeckt und 2015 mit dem Nobelpreis ausgezeichnet. Seine Verwendung als Anthelminthikum ist bis heute aktiv. Aufgrund der raschen Entwicklung von Resistenzen gegen Avermectine bei Nematoden und Schadinsekten ist jedoch eine alternative, kostengünstige und umweltfreundliche Strategie zur Bekämpfung des Kiefernfadenwurmbefalls erforderlich. Diese Studie beschreibt außerdem den Mechanismus, durch den 5-Iodoindol Kiefernfadenwürmer abtötet, und zeigt, dass 5-Iodoindol eine geringe Toxizität für Pflanzenzellen aufweist, was gute Aussichten für seine zukünftige kommerzielle Anwendung eröffnet.
Alle Experimente wurden vom Ethikkomitee der Yeungnam-Universität, Gyeongsan, Korea, genehmigt und die Methoden wurden gemäß den Richtlinien des Ethikkomitees der Yeungnam-Universität durchgeführt.
Es wurden Eier-Inkubationsexperimente nach etablierten Verfahren durchgeführt43. Zur Bestimmung der Schlupfraten (HR) wurden 1 Tag alte adulte Nematoden (etwa 100 Weibchen und 100 Männchen) in Petrischalen mit dem Pilz gegeben und 24 Stunden lang wachsen gelassen. Anschließend wurden die Eier isoliert und mit 5-Iodoindol (0,05 mM und 0,1 mM) oder Avermectin (10 μg/ml) als Suspension in sterilem destilliertem Wasser behandelt. Diese Suspensionen (500 μl; etwa 100 Eier) wurden in die Vertiefungen einer 24-Well-Gewebekulturplatte gegeben und bei 22 °C inkubiert. L2-Zählungen wurden nach 24 Stunden Inkubation durchgeführt, galten aber als tot, wenn sich die Zellen bei Stimulation mit einem feinen Platindraht nicht bewegten. Dieses Experiment wurde in zwei Phasen mit jeweils sechs Wiederholungen durchgeführt. Die Daten aus beiden Experimenten wurden kombiniert und präsentiert. Der Prozentsatz der HR wird wie folgt berechnet:
Die Larvenmortalität wurde anhand zuvor entwickelter Verfahren ermittelt. Nematodeneier wurden gesammelt und Embryonen durch Ausbrüten in sterilem destilliertem Wasser synchronisiert, um Larven im L2-Stadium zu erzeugen. Die synchronisierten Larven (ungefähr 500 Nematoden) wurden mit 5-Iodoindol (0,05 mM und 0,1 mM) oder Avermectin (10 μg/ml) behandelt und auf B. cinerea-Petrischalen gezüchtet. Nach 48-stündiger Inkubation bei 22 °C wurden die Nematoden in sterilem destilliertem Wasser gesammelt und auf das Vorhandensein der Stadien L2, L3 und L4 untersucht. Das Vorhandensein der Stadien L3 und L4 deutete auf eine Larventransformation hin, während das Vorhandensein des L2-Stadiums keine Transformation anzeigte. Die Bilder wurden mit dem iRiS™ Digital Cell Imaging System aufgenommen. Dieses Experiment wurde in zwei Phasen mit jeweils sechs Wiederholungen durchgeführt. Die Daten aus beiden Experimenten wurden kombiniert und präsentiert.
Die Toxizität von 5-Iodoindol und Avermectin für Samen wurde mithilfe von Keimungstests auf Murashige- und Skoog-Agarplatten untersucht.62 B. oleracea- und R. raphanistrum-Samen wurden zunächst einen Tag lang in sterilem destilliertem Wasser eingeweicht, mit 1 ml 100%igem Ethanol gewaschen, 15 Minuten lang mit 1 ml 50%igem handelsüblichem Bleichmittel (3% Natriumhypochlorit) sterilisiert und fünfmal mit 1 ml sterilem Wasser gewaschen. Die sterilisierten Samen wurden dann auf Keimungsagarplatten gedrückt, die 0,86 g/l (0,2X) Murashige- und Skoog-Medium und 0,7% bakteriologischen Agar mit oder ohne 5-Iodoindol oder Avermectin enthielten. Die Platten wurden dann bei 22 °C inkubiert und nach drei Tagen Inkubation wurden Bilder aufgenommen. Dieses Experiment wurde in zwei Phasen mit jeweils sechs Wiederholungen durchgeführt.
Veröffentlichungszeit: 26. Februar 2025