Der Kiefernnematode ist ein Quarantäne-bedingter, wandernder Endoparasit, der in Kiefernwaldökosystemen erhebliche wirtschaftliche Schäden verursacht. Die vorliegende Studie untersucht die nematizide Wirkung halogenierter Indole gegen Kiefernnematoden und deren Wirkmechanismus. Die nematizide Wirkung von 5-Iodindol und Avermectin (positive Kontrolle) gegen Kiefernnematoden war bei niedrigen Konzentrationen (10 μg/ml) vergleichbar und hoch. 5-Iodindol reduzierte die Fruchtbarkeit, die Reproduktionsaktivität, die Embryonal- und Larvensterblichkeit sowie das Bewegungsverhalten. Molekulare Interaktionen der Liganden mit wirbellosenspezifischen, glutamatgesteuerten Chloridkanalrezeptoren stützen die Annahme, dass 5-Iodindol, ähnlich wie Avermectin, fest an das aktive Zentrum des Rezeptors bindet. 5-Iodindol induzierte zudem verschiedene phänotypische Veränderungen bei den Nematoden, darunter abnormalen Organkollaps/-schrumpfung und verstärkte Vakuolisierung. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Vakuolen eine Rolle beim durch Methylierung vermittelten Tod von Nematoden spielen könnten. Wichtig ist, dass 5-Iodindol für beide Pflanzenarten (Kohl und Rettich) ungiftig war. Somit zeigt diese Studie, dass die Anwendung von Iodindol unter Umweltbedingungen Schäden durch Kiefernwelke eindämmen kann.
Der Kiefernholznematode (Bursaphelenchus xylophilus) gehört zu den Kiefernholznematoden (PWN), wandernden endoparasitären Nematoden, die bekanntermaßen schwere ökologische Schäden in Kiefernwaldökosystemen verursachen1. Die durch den Kiefernholznematoden verursachte Kiefernholzkrankheit (PWD) entwickelt sich zu einem ernsthaften Problem auf mehreren Kontinenten, darunter Asien und Europa. In Nordamerika zerstört der Nematode eingeführte Kiefernarten1,2. Das Kiefernsterben ist ein bedeutendes wirtschaftliches Problem, und die Aussicht auf seine weltweite Ausbreitung ist besorgniserregend3. Folgende Kiefernarten werden am häufigsten von dem Nematoden befallen: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii und Pinus radiata4. Der Kiefernholznematode ist eine schwerwiegende Krankheit, die Kiefern innerhalb von Wochen oder Monaten nach der Infektion abtöten kann. Darüber hinaus sind Ausbrüche des Kiefernnematodenbefalls in einer Vielzahl von Ökosystemen häufig, sodass sich persistente Infektionsketten etabliert haben1.
Bursaphelenchus xylophilus ist ein Quarantäne-Pflanzenparasit aus der Überfamilie Aphelenchoidea (Klade 102.5). Der Nematode ernährt sich von Pilzen und vermehrt sich im Holzgewebe von Kiefern. Er durchläuft vier verschiedene Larvenstadien: L1, L2, L3, L4 und das adulte Individuum1,6. Bei Nahrungsmangel verfällt der Kiefernnematode in ein spezialisiertes Dauerstadium, in dem er seinen Vektor, den Kiefernborkenkäfer (Monochamus alternatus), parasitiert und auf gesunde Kiefern übertragen wird. In gesunden Wirtsbäumen wandern die Nematoden schnell durch das Pflanzengewebe und ernähren sich von Parenchymzellen. Dies führt zu einer Reihe von Überempfindlichkeitsreaktionen, Welke und innerhalb eines Jahres nach der Infektion zum Tod der Kiefer1,7,8.
Die biologische Bekämpfung von Kiefernnematoden stellt seit Langem eine Herausforderung dar, und Quarantänemaßnahmen reichen bis ins 20. Jahrhundert zurück. Aktuelle Bekämpfungsstrategien basieren hauptsächlich auf chemischen Behandlungen, darunter Holzbegasung und die Implantation von Nematiziden in Baumstämme. Die am häufigsten verwendeten Nematizide sind Avermectin und Avermectinbenzoat, die zur Avermectin-Familie gehören. Diese teuren Chemikalien sind hochwirksam gegen viele Nematodenarten und gelten als umweltverträglich.9 Es ist jedoch zu erwarten, dass die wiederholte Anwendung dieser Nematizide einen Selektionsdruck erzeugt, der mit hoher Wahrscheinlichkeit zur Entstehung resistenter Kiefernnematoden führt. Dies wurde bereits bei verschiedenen Insektenschädlingen beobachtet, beispielsweise bei Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella sowie den Nematoden Trichostrongylus colubriformis und Ostertagia circumcincta, die allmählich Resistenzen gegen Avermectine entwickelt haben.10,11,12 Daher müssen Resistenzmuster regelmäßig untersucht und Nematizide kontinuierlich getestet werden, um alternative, kostengünstige und umweltfreundliche Maßnahmen zur Bekämpfung der PVD zu finden. In den letzten Jahrzehnten haben mehrere Autoren die Verwendung von Pflanzenextrakten, ätherischen Ölen und flüchtigen Verbindungen als Mittel zur Nematodenbekämpfung vorgeschlagen.13,14,15,16
Wir haben kürzlich die nematizide Wirkung von Indol, einem interzellulären und interspezifischen Signalmolekül, in Caenorhabditis elegans nachgewiesen17. Indol ist ein weit verbreitetes intrazelluläres Signalmolekül in der mikrobiellen Ökologie und reguliert zahlreiche Funktionen, die die mikrobielle Physiologie, Sporenbildung, Plasmidstabilität, Arzneimittelresistenz, Biofilmbildung und Virulenz beeinflussen18,19. Die Wirkung von Indol und seinen Derivaten gegen andere pathogene Nematoden wurde bisher nicht untersucht. In der vorliegenden Studie untersuchten wir die nematizide Wirkung von 34 Indolen gegen Kiefernnematoden und klärten den Wirkmechanismus des wirksamsten 5-Iodindols mittels Mikroskopie, Zeitrafferaufnahmen und molekularen Docking-Experimenten auf. Zudem bewerteten wir seine toxischen Effekte auf Pflanzen mithilfe eines Keimungstests.
Hohe Indolkonzentrationen (>1,0 mM) zeigten bereits eine nematizide Wirkung auf Nematoden17. Nach der Behandlung von B. xylophilus (verschiedene Entwicklungsstadien) mit Indol oder 33 verschiedenen Indolderivaten (jeweils 1 mM) wurde die Mortalität der Nematoden durch Zählen lebender und toter Tiere in der Kontroll- und den Behandlungsgruppen bestimmt. Fünf Indole wiesen eine signifikante nematizide Wirkung auf; die Überlebensrate der unbehandelten Kontrollgruppe betrug nach 24 h 95 ± 7 %. Von den 34 getesteten Indolen verursachten 5-Iodindol und 4-Fluorindol (jeweils 1 mM) eine Mortalität von 100 %, während 5,6-Difluorindigo, Methylindol-7-carboxylat und 7-Iodindol eine Mortalität von etwa 50 % bewirkten (Tabelle 1).
Einfluss von 5-Iodindol auf die Vakuolenbildung und den Stoffwechsel des Kiefernholznematoden. (A) Wirkung von Avermectin und 5-Iodindol auf adulte männliche Nematoden, (B) Nematodeneier im L1-Stadium und (C) Stoffwechsel von B. xylophilus. (i) Nach 0 h waren keine Vakuolen zu beobachten. Die Behandlung führte zu (ii) Vakuolenbildung, (iii) Akkumulation mehrerer Vakuolen, (iv) Schwellung der Vakuolen, (v) Verschmelzung der Vakuolen und (vi) Bildung von Riesenvakuolen. Rote Pfeile kennzeichnen die Schwellung der Vakuolen, blaue Pfeile die Verschmelzung der Vakuolen und schwarze Pfeile die Bildung von Riesenvakuolen. Maßstab = 50 μm.
Darüber hinaus beschrieb diese Studie den sequenziellen Prozess des methaninduzierten Zelltods bei Kiefernnematoden (Abbildung 4C). Methanogener Zelltod ist eine nicht-apoptotische Form des Zelltods, die mit der Akkumulation ausgeprägter zytoplasmatischer Vakuolen einhergeht27. Die bei Kiefernnematoden beobachteten morphologischen Defekte scheinen eng mit dem Mechanismus des methaninduzierten Zelltods zusammenzuhängen. Mikroskopische Untersuchungen zu verschiedenen Zeitpunkten zeigten, dass sich nach 20 Stunden Exposition gegenüber 5-Iodindol (0,1 mM) riesige Vakuolen bildeten. Mikroskopische Vakuolen waren nach 8 Stunden Behandlung sichtbar, und ihre Anzahl nahm nach 12 Stunden zu. Nach 14 Stunden wurden mehrere große Vakuolen beobachtet. Mehrere fusionierte Vakuolen waren nach 12–16 Stunden Behandlung deutlich erkennbar, was darauf hindeutet, dass die Vakuolenfusion die Grundlage des methanogenen Zelltodmechanismus bildet. Nach 20 Stunden fanden sich im gesamten Wurm mehrere riesige Vakuolen. Diese Beobachtungen stellen den ersten Bericht über Metuosis bei C. elegans dar.
Bei mit 5-Iodindol behandelten Würmern wurden ebenfalls Vakuolenaggregation und -ruptur beobachtet (Abb. 5), was sich durch Krümmung der Würmer und Freisetzung der Vakuolen in die Umgebung äußerte. Auch in der Eischalenmembran, die normalerweise von den L2-Larven beim Schlüpfen intakt gehalten wird, wurde eine Vakuolenruptur festgestellt (Abb. S2 im Anhang). Diese Beobachtungen stützen die Annahme, dass Flüssigkeitsansammlungen und osmoregulatorische Störungen sowie reversible Zellschädigungen (RCI) an der Vakuolenbildung und -eiterung beteiligt sind (Abb. 5).
Ausgehend von der Hypothese, dass Iod bei der beobachteten Vakuolenbildung eine Rolle spielt, untersuchten wir die nematizide Wirkung von Natriumiodid (NaI) und Kaliumiodid (KI). In den getesteten Konzentrationen (0,1, 0,5 oder 1 mM) beeinflussten sie jedoch weder das Überleben der Nematoden noch die Vakuolenbildung (Abb. S5 im Anhang), obwohl 1 mM KI eine geringe nematizide Wirkung zeigte. 7-Iodindol (1 oder 2 mM) induzierte hingegen, ähnlich wie 5-Iodindol, multiple Vakuolen und Strukturveränderungen (Abb. S6 im Anhang). Die beiden Iodindole zeigten ähnliche phänotypische Merkmale in Kiefernnematoden, NaI und KI hingegen nicht. Interessanterweise induzierte Indol in den getesteten Konzentrationen keine Vakuolenbildung in B. xylophilus (Daten nicht gezeigt). Die Ergebnisse bestätigten somit, dass der Indol-Iod-Komplex für die Vakuolisierung und den Stoffwechsel von B. xylophilus verantwortlich ist.
Unter den auf nematizide Aktivität getesteten Indolen wies 5-Iodindol den höchsten Gleitindex von -5,89 kcal/mol auf, gefolgt von 7-Iodindol (-4,48 kcal/mol), 4-Fluorindol (-4,33) und Indol (-4,03) (Abbildung 6). Die starke Wasserstoffbrückenbindung des 5-Iodindol-Rückgrats an Leucin 218 stabilisiert dessen Bindung, während alle anderen Indolderivate über Wasserstoffbrückenbindungen der Seitenketten an Serin 260 binden. Unter den modellierten Iodindolen weist 2-Iodindol einen Bindungswert von -5,248 kcal/mol auf, der auf seine Hauptwasserstoffbrücke mit Leucin 218 zurückzuführen ist. Weitere bekannte Bindungswerte umfassen 3-Iodindol (-4,3 kcal/mol), 4-Iodindol (-4,0 kcal/mol) und 6-Fluorindol (-2,6 kcal/mol) (Ergänzende Abbildung S8). Die meisten halogenierten Indole und Indol selbst, mit Ausnahme von 5-Iodindol und 2-Iodindol, bilden eine Bindung mit Serin 260. Die Tatsache, dass Wasserstoffbrückenbindungen mit Leucin 218 auf eine effiziente Rezeptor-Ligand-Bindung hinweisen, wie sie für Ivermectin beobachtet wurde (Abb. S7 im Anhang), bestätigt, dass 5-Iodindol und 2-Iodindol, ähnlich wie Ivermectin, über Leucin 218 fest an das aktive Zentrum des GluCL-Rezeptors binden (Abb. 6 und Abb. S8 im Anhang). Wir vermuten, dass diese Bindung für die Aufrechterhaltung der offenen Porenstruktur des GluCL-Komplexes notwendig ist und dass 5-Iodindol, 2-Iodindol, Avermectin und Ivermectin durch die feste Bindung an das aktive Zentrum des GluCL-Rezeptors den Ionenkanal offen halten und so die Flüssigkeitsaufnahme ermöglichen.
Molekulares Docking von Indol und halogeniertem Indol an GluCL. Bindungsorientierungen der Liganden (A) Indol, (B) 4-Fluorindol, (C) 7-Iodindol und (D) 5-Iodindol an das aktive Zentrum von GluCL. Das Protein ist als Bandmodell dargestellt, die Wasserstoffbrückenbindungen des Proteinrückgrats sind als gelbe gestrichelte Linien abgebildet. (A′), (B′), (C′) und (D′) zeigen die Wechselwirkungen der entsprechenden Liganden mit den umgebenden Aminosäureresten, die Wasserstoffbrückenbindungen der Seitenketten sind durch rosa gestrichelte Pfeile gekennzeichnet.
Es wurden Experimente durchgeführt, um die toxische Wirkung von 5-Iodindol auf die Keimung von Kohl- und Radieschensamen zu untersuchen. 5-Iodindol (0,05 oder 0,1 mM) oder Avermectin (10 μg/ml) hatten nur geringe oder keine Auswirkungen auf die Keimung und das Auflaufen der Keimlinge (Abbildung 7). Darüber hinaus wurde kein signifikanter Unterschied zwischen der Keimungsrate unbehandelter Kontrollen und mit 5-Iodindol oder Avermectin behandelten Samen festgestellt. Die Wirkung auf das Längenwachstum der Hauptwurzel und die Anzahl der gebildeten Seitenwurzeln war unbedeutend, obwohl 1 mM (das Zehnfache der Wirkstoffkonzentration) 5-Iodindol die Entwicklung der Seitenwurzeln leicht verzögerte. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass 5-Iodindol in den untersuchten Konzentrationen für Pflanzenzellen ungiftig ist und die Pflanzenentwicklung nicht beeinträchtigt.
Einfluss von 5-Iodindol auf die Samenkeimung. Keimung, Austrieb und Seitenwurzelbildung von Samen von *Brassica oleracea* und *Rhizomia raphanistrum* auf Murashige- und Skoog-Agar mit und ohne Avermectin oder 5-Iodindol. Die Keimung wurde nach 3 Tagen Inkubation bei 22 °C dokumentiert.
Diese Studie berichtet über mehrere Fälle der Nematodenabtötung durch Indole. Besonders hervorzuheben ist, dass dies der erste Bericht über die Methylierung von Kiefernnadeln durch Iodindol ist (ein Prozess, der durch die Ansammlung kleiner Vakuolen verursacht wird, die allmählich zu riesigen Vakuolen verschmelzen und schließlich zum Membranbruch und Tod führen). Iodindol zeigt dabei signifikante nematizide Eigenschaften, die denen des kommerziellen Nematizids Avermectin ähneln.
Indole üben bekanntermaßen vielfältige Signalwirkungen in Prokaryoten und Eukaryoten aus, darunter die Hemmung/Bildung von Biofilmen, das Überleben von Bakterien und die Pathogenität19,32,33,34. In jüngster Zeit haben die potenziellen therapeutischen Effekte halogenierter Indole, Indolalkaloide und halbsynthetischer Indolderivate großes Forschungsinteresse geweckt35,36,37. So konnte beispielsweise gezeigt werden, dass halogenierte Indole persistente Zellen von Escherichia coli und Staphylococcus aureus abtöten37. Darüber hinaus ist es von wissenschaftlichem Interesse, die Wirksamkeit halogenierter Indole gegen andere Arten, Gattungen und Reiche zu untersuchen, und diese Studie ist ein Schritt zur Erreichung dieses Ziels.
Wir schlagen hier einen Mechanismus für die durch 5-Iodindol induzierte Letalität in C. elegans vor, der auf reversibler Zellschädigung (RCI) und Methylierung basiert (Abbildungen 4C und 5). Ödematöse Veränderungen wie Schwellungen und vakuoläre Degeneration sind Indikatoren für RCI und Methylierung und manifestieren sich als riesige Vakuolen im Zytoplasma48,49. RCI beeinträchtigt die Energieproduktion, indem es die ATP-Produktion reduziert, zum Ausfall der ATPase-Pumpe führt oder Zellmembranen schädigt und einen raschen Einstrom von Na+, Ca2+ und Wasser verursacht50,51,52. Intrazelluläre Vakuolen entstehen in tierischen Zellen durch Flüssigkeitsansammlung im Zytoplasma aufgrund des Einstroms von Ca2+ und Wasser53. Interessanterweise ist dieser Mechanismus der Zellschädigung reversibel, wenn die Schädigung vorübergehend ist und die Zellen für eine gewisse Zeit wieder ATP produzieren; hält die Schädigung jedoch an oder verschlimmert sie sich, sterben die Zellen ab.54 Unsere Beobachtungen zeigen, dass mit 5-Iodindol behandelte Nematoden nach Stressbelastung nicht in der Lage sind, die normale Biosynthese wiederherzustellen.
Der durch 5-Iodindol in B. xylophilus induzierte Methylierungsphänotyp könnte auf das Vorhandensein von Iod und dessen molekulare Verteilung zurückzuführen sein, da 7-Iodindol eine geringere Hemmwirkung auf B. xylophilus zeigte als 5-Iodindol (Tabelle 1 und Abbildung S6 im Anhang). Diese Ergebnisse stimmen teilweise mit den Studien von Maltese et al. (2014) überein, die berichteten, dass die Translokation des Pyridylstickstoffs im Indol von der para- in die meta-Position die Vakuolisierung, die Wachstumshemmung und die Zytotoxizität in U251-Zellen aufhob. Dies deutet darauf hin, dass die Interaktion des Moleküls mit einem spezifischen aktiven Zentrum im Protein entscheidend ist.27,44,45 Die in dieser Studie beobachteten Wechselwirkungen zwischen Indol bzw. halogenierten Indolen und GluCL-Rezeptoren stützen diese Annahme. 5- und 2-Iodindol binden stärker an GluCL-Rezeptoren als die anderen untersuchten Indole (Abbildung 6 und ergänzende Abbildung S8). Das Iod an Position 2 bzw. 5 des Indols bindet über Wasserstoffbrückenbindungen des Peptidrückgrats an Leucin 218 des GluCL-Rezeptors, während andere halogenierte Indole und Indol selbst schwache Wasserstoffbrückenbindungen der Seitenketten mit Serin 260 ausbilden (Abbildung 6). Wir vermuten daher, dass die Lokalisierung des Halogens eine wichtige Rolle bei der Induktion der Vakuolendegeneration spielt, während die starke Bindung von 5-Iodindol den Ionenkanal offen hält und so einen schnellen Flüssigkeitseinstrom und die Ruptur der Vakuole ermöglicht. Der genaue Wirkmechanismus von 5-Iodindol ist jedoch noch nicht vollständig aufgeklärt.
Vor der praktischen Anwendung von 5-Iodindol sollte dessen toxische Wirkung auf Pflanzen untersucht werden. Unsere Keimungsversuche zeigten, dass 5-Iodindol in den untersuchten Konzentrationen keine negativen Auswirkungen auf die Keimung oder die nachfolgende Entwicklung der Samen hatte (Abbildung 7). Diese Studie liefert somit eine Grundlage für den Einsatz von 5-Iodindol im ökologischen Bereich zur Bekämpfung des Kiefernälchenbefalls.
Frühere Studien haben gezeigt, dass die Therapie mit Indolen einen potenziellen Ansatz zur Bekämpfung von Antibiotikaresistenzen und zur Verhinderung des Fortschreitens von Krebs darstellt55. Darüber hinaus besitzen Indole antibakterielle, antikanzerogene, antioxidative, entzündungshemmende, antidiabetische, antivirale, antiproliferative und antituberkulöse Eigenschaften und könnten eine vielversprechende Grundlage für die Arzneimittelentwicklung bilden56,57. Diese Studie legt erstmals die potenzielle Anwendung von Jod als antiparasitäres und anthelmintisches Mittel nahe.
Avermectin wurde vor drei Jahrzehnten entdeckt und 2015 mit dem Nobelpreis ausgezeichnet. Seine Anwendung als Anthelminthikum ist nach wie vor weit verbreitet. Aufgrund der raschen Resistenzentwicklung gegen Avermectine bei Nematoden und Insektenschädlingen ist jedoch eine alternative, kostengünstige und umweltfreundliche Strategie zur Bekämpfung des Kiefernholznematodenbefalls (PWN) in Kiefern erforderlich. Diese Studie beschreibt zudem den Wirkmechanismus von 5-Iodindol gegen Kiefernholznematoden und zeigt dessen geringe Toxizität für Pflanzenzellen, was vielversprechende Perspektiven für eine zukünftige kommerzielle Anwendung eröffnet.
Alle Experimente wurden von der Ethikkommission der Yeungnam University, Gyeongsan, Korea, genehmigt, und die Methoden wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Ethikkommission der Yeungnam University durchgeführt.
Eierbrutversuche wurden nach etablierten Verfahren43 durchgeführt. Zur Bestimmung der Schlupfrate (HR) wurden 1 Tag alte adulte Nematoden (ca. 100 Weibchen und 100 Männchen) in Petrischalen mit dem Pilz überführt und 24 h lang inkubiert. Anschließend wurden die Eier isoliert und mit 5-Iodindol (0,05 mM und 0,1 mM) oder Avermectin (10 μg/ml) als Suspension in sterilem destilliertem Wasser behandelt. Diese Suspensionen (500 μl; ca. 100 Eier) wurden in die Vertiefungen einer 24-Well-Zellkulturplatte überführt und bei 22 °C inkubiert. Die Anzahl der L2-Larven wurde nach 24 h Inkubation bestimmt. Zellen, die sich bei Stimulation mit einem feinen Platindraht nicht bewegten, wurden als tot betrachtet. Der Versuch wurde in zwei Phasen mit jeweils sechs Wiederholungen durchgeführt. Die Daten beider Versuche wurden zusammengeführt und dargestellt. Die prozentuale Schlupfrate wurde wie folgt berechnet:
Die Larvensterblichkeit wurde anhand zuvor entwickelter Verfahren bestimmt. Nematodeneier wurden gesammelt und die Embryonen durch Schlüpfen in sterilem destilliertem Wasser synchronisiert, um Larven im L2-Stadium zu erhalten. Die synchronisierten Larven (ca. 500 Nematoden) wurden mit 5-Iodindol (0,05 mM und 0,1 mM) oder Avermectin (10 μg/ml) behandelt und auf Petrischalen mit *B. cinerea* aufgezogen. Nach 48 Stunden Inkubation bei 22 °C wurden die Nematoden in sterilem destilliertem Wasser gesammelt und auf das Vorhandensein der Stadien L2, L3 und L4 untersucht. Das Vorhandensein der Stadien L3 und L4 deutete auf eine Larvenentwicklung hin, während das Vorhandensein des Stadiums L2 keine Entwicklung anzeigte. Die Bilder wurden mit dem iRiS™ Digital Cell Imaging System aufgenommen. Das Experiment wurde in zwei Phasen mit jeweils sechs Wiederholungen durchgeführt. Die Daten beider Experimente wurden zusammengeführt und dargestellt.
Die Toxizität von 5-Iodindol und Avermectin gegenüber Samen wurde mittels Keimungstests auf Murashige- und Skoog-Agarplatten untersucht.62 Samen von Brassica oleracea und Rhizomia raphanistrum wurden zunächst einen Tag lang in sterilem destilliertem Wasser eingeweicht, mit 1 ml 100%igem Ethanol gewaschen, 15 Minuten lang mit 1 ml 50%iger handelsüblicher Bleichlösung (3% Natriumhypochlorit) sterilisiert und anschließend fünfmal mit je 1 ml sterilem Wasser gewaschen. Die sterilisierten Samen wurden dann auf Keimungsagarplatten mit 0,86 g/l (0,2x) Murashige- und Skoog-Medium und 0,7% bakteriologischem Agar mit oder ohne 5-Iodindol bzw. Avermectin ausgedrückt. Die Platten wurden anschließend bei 22 °C inkubiert und nach drei Tagen fotografiert. Das Experiment wurde in zwei Phasen mit jeweils sechs Wiederholungen durchgeführt.
Veröffentlichungsdatum: 26. Februar 2025