Der Kiefernnematode ist ein wandernder Quarantäne-Endoparasit, der bekanntermaßen schwere wirtschaftliche Verluste in Kiefernwald-Ökosystemen verursacht. Die vorliegende Studie untersucht die nematizide Aktivität halogenierter Indole gegen Kiefernnematoden und ihren Wirkungsmechanismus. Die nematizide Aktivität von 5-Iodoindol und Avermectin (positive Kontrolle) gegen Kiefernnematoden war bei niedrigen Konzentrationen (10 μg/ml) ähnlich und hoch. 5-Iodoindol verringerte Fruchtbarkeit, Reproduktionsaktivität, Embryo- und Larvenmortalität sowie das Bewegungsverhalten. Molekulare Wechselwirkungen von Liganden mit wirbellosenspezifischen Glutamat-gesteuerten Chloridkanalrezeptoren stützen die Annahme, dass 5-Iodoindol, wie Avermectin, fest an das aktive Zentrum des Rezeptors bindet. 5-Iodoindol induzierte außerdem verschiedene phänotypische Deformationen bei Nematoden, darunter abnormalen Organkollaps/-schrumpfung und erhöhte Vakuolisierung. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Vakuolen beim durch Methylierung vermittelten Tod von Nematoden eine Rolle spielen könnten. Wichtig ist, dass 5-Iodoindol für beide Pflanzenarten (Kohl und Rettich) ungiftig war. Somit zeigt diese Studie, dass die Anwendung von Iodoindol unter Umweltbedingungen die Kiefernwelke kontrollieren kann.
Der Kiefernholznematode (Bursaphelenchus xylophilus) gehört zu den Kiefernholznematoden (PWN), wandernden endoparasitären Fadenwürmern, die bekanntermaßen schwere ökologische Schäden an Kiefernwald-Ökosystemen verursachen1. Die durch den Kiefernholznematoden verursachte Kiefernwelke (PWD) wird auf mehreren Kontinenten, darunter Asien und Europa, zu einem ernsten Problem und in Nordamerika vernichtet der Fadenwurm eingeführte Kiefernarten1,2. Das Kiefernsterben ist ein großes wirtschaftliches Problem und die Aussicht auf seine weltweite Ausbreitung ist besorgniserregend3. Folgende Kiefernarten werden am häufigsten von dem Fadenwurm befallen: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii und Pinus radiata4. Der Kiefernnematode ist eine ernste Krankheit, die Kiefern innerhalb von Wochen oder Monaten nach der Infektion töten kann. Darüber hinaus kommt es in zahlreichen Ökosystemen häufig zu Ausbrüchen des Kiefernfadenwurms, so dass sich anhaltende Infektionsketten gebildet haben1.
Bursaphelenchus xylophilus ist ein pflanzenparasitärer Quarantäne-Fadenwurm aus der Überfamilie Aphelenchoidea und Klade 102.5. Der Fadenwurm ernährt sich von Pilzen und vermehrt sich im Holzgewebe von Kiefern. Dabei entwickelt er sich zu vier verschiedenen Larvenstadien: L1, L2, L3, L4 und einem adulten Individuum1,6. Bei Nahrungsknappheit entwickelt sich der Kiefernfadenwurm zu einem spezialisierten Larvenstadium – der Dauer. Dieses parasitiert seinen Vektor, den Borkenkäfer (Monochamus alternatus), und wird auf gesunde Kiefern übertragen. In gesunden Wirten wandern die Fadenwürmer schnell durch das Pflanzengewebe und ernähren sich von Parenchymzellen. Dies führt zu einer Reihe von Überempfindlichkeitsreaktionen, Kiefernwelke und Tod innerhalb eines Jahres nach der Infektion1,7,8.
Die biologische Bekämpfung von Kiefernnematoden ist seit langem eine Herausforderung, wobei Quarantänemaßnahmen bis ins 20. Jahrhundert zurückreichen. Aktuelle Strategien zur Bekämpfung von Kiefernnematoden umfassen hauptsächlich chemische Behandlungen, darunter Holzbegasung und die Implantation von Nematiziden in Baumstämme. Die am häufigsten verwendeten Nematizide sind Avermectin und Avermectinbenzoat, die zur Avermectin-Familie gehören. Diese teuren Chemikalien sind hochwirksam gegen viele Nematodenarten und gelten als umweltverträglich9. Es ist jedoch zu erwarten, dass die wiederholte Anwendung dieser Nematizide einen Selektionsdruck erzeugt, der mit ziemlicher Sicherheit zur Entstehung resistenter Kiefernnematoden führt, wie für mehrere Schadinsekten wie Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella und die Nematoden Trichostrongylus colubriformis und Ostertagia circumcincta gezeigt wurde, die allmählich eine Resistenz gegen Avermectine entwickelt haben10,11,12. Daher müssen Resistenzmuster regelmäßig untersucht und Nematizide kontinuierlich geprüft werden, um alternative, kostengünstige und umweltfreundliche Maßnahmen zur Kontrolle der PVD zu finden. In den letzten Jahrzehnten haben zahlreiche Autoren die Verwendung von Pflanzenextrakten, ätherischen Ölen und flüchtigen Stoffen als Mittel zur Nematodenbekämpfung vorgeschlagen13,14,15,16.
Wir haben vor kurzem die nematizide Aktivität von Indol, einem interzellulären und interkönigreichsübergreifenden Signalmolekül, in Caenorhabditis elegans nachgewiesen 17 . Indol ist ein weit verbreitetes intrazelluläres Signal in der mikrobiellen Ökologie, das zahlreiche Funktionen steuert, die die mikrobielle Physiologie, Sporenbildung, Plasmid-Stabilität, Arzneimittelresistenz, Biofilmbildung und Virulenz beeinflussen 18, 19 . Die Aktivität von Indol und seinen Derivaten gegen andere pathogene Nematoden wurde nicht untersucht. In dieser Studie untersuchten wir die nematizide Aktivität von 34 Indolen gegen Kiefernnematoden und erläuterten den Wirkungsmechanismus des wirksamsten 5-Iodoindols mithilfe von Mikroskopie, Zeitrafferfotografie und molekularen Docking-Experimenten. Außerdem bewerteten wir seine toxischen Auswirkungen auf Pflanzen mithilfe eines Samenkeimungstests.
Hohe Konzentrationen (> 1,0 mM) Indol haben bereits eine nematizide Wirkung auf Nematoden17. Nach der Behandlung von B. xylophilus (gemischte Stadien) mit Indol oder 33 verschiedenen Indolderivaten in einer Konzentration von 1 mM wurde die Mortalität von B. xylophilus durch Zählen der lebenden und toten Nematoden in der Kontroll- und Behandlungsgruppe gemessen. Fünf Indole zeigten eine signifikante nematizide Wirkung; die Überlebensrate der unbehandelten Kontrollgruppe betrug nach 24 Stunden 95 ± 7 %. Von den 34 getesteten Indolen verursachten 5-Iodindol und 4-Fluorindol in einer Konzentration von 1 mM eine Mortalität von 100 %, während 5,6-Difluorindigo, Methylindol-7-carboxylat und 7-Iodindol eine Mortalität von etwa 50 % verursachten (Tabelle 1).
Einfluss von 5-Iodoindol auf die Vakuolenbildung und den Stoffwechsel von Kiefernholznematoden. (A) Einfluss von Avermectin und 5-Iodoindol auf adulte männliche Nematoden, (B) Nematodeneier im L1-Stadium und (C) Stoffwechsel von B. xylophilus. (i) Vakuolen wurden nach 0 Stunden nicht beobachtet; die Behandlung führte zu (ii) Vakuolen, (iii) Ansammlung multipler Vakuolen, (iv) Schwellung der Vakuolen, (v) Verschmelzung der Vakuolen und (vi) Bildung von Riesenvakuolen. Rote Pfeile zeigen Schwellung der Vakuolen an, blaue Pfeile Verschmelzung der Vakuolen und schwarze Pfeile Riesenvakuolen. Maßstab = 50 μm.
Zudem beschrieb diese Studie den sequentiellen Prozess des durch Methan verursachten Zelltods bei Kiefernnematoden (Abbildung 4C). Der methanogene Zelltod ist eine nicht-apoptotische Art des Zelltods, die mit der Ansammlung auffälliger zytoplasmatischer Vakuolen einhergeht27. Die bei Kiefernnematoden beobachteten morphologischen Defekte scheinen eng mit dem Mechanismus des durch Methan verursachten Zelltods zusammenzuhängen. Mikroskopische Untersuchungen zu verschiedenen Zeitpunkten zeigten, dass sich nach 20-stündiger Einwirkung von 5-Iodindol (0,1 mM) Riesenvakuolen bildeten. Nach 8-stündiger Behandlung wurden mikroskopische Vakuolen beobachtet, und ihre Zahl nahm nach 12 Stunden zu. Nach 14 Stunden wurden mehrere große Vakuolen beobachtet. Nach 12- bis 16-stündiger Behandlung waren mehrere verschmolzene Vakuolen deutlich sichtbar, was darauf hindeutet, dass die Vakuolenfusion die Grundlage des methanogenen Todesmechanismus ist. Nach 20 Stunden wurden im gesamten Wurm mehrere Riesenvakuolen gefunden. Diese Beobachtungen stellen den ersten Bericht über Metuose bei C. elegans dar.
Bei mit 5-Iodoindol behandelten Würmern wurden auch Vakuolenaggregation und -ruptur beobachtet (Abb. 5), was sich in der Wurmbiegung und der Vakuolenfreisetzung in die Umwelt zeigte. Auch in der Eierschalenmembran, die normalerweise während des Schlüpfens von L2 intakt gehalten wird, wurde eine Vakuolenzerstörung beobachtet (Ergänzende Abb. S2). Diese Beobachtungen stützen die Beteiligung von Flüssigkeitsansammlung und osmoregulatorischem Versagen sowie reversibler Zellschädigung (RCI) am Prozess der Vakuolenbildung und -eiterung (Abb. 5).
Wir stellten Hypothesen über die Rolle von Jod bei der beobachteten Vakuolenbildung auf und untersuchten die nematizide Wirkung von Natriumiodid (NaI) und Kaliumiodid (KI). In Konzentrationen (0,1, 0,5 oder 1 mM) beeinflussten sie jedoch weder das Überleben der Nematoden noch die Vakuolenbildung (Ergänzende Abbildung S5), obwohl 1 mM KI eine leichte nematizide Wirkung hatte. Andererseits induzierte 7-Iodoindol (1 oder 2 mM) ebenso wie 5-Iodoindol multiple Vakuolen und strukturelle Deformationen (Ergänzende Abbildung S6). Die beiden Iodoindole zeigten ähnliche phänotypische Merkmale in Kiefernnematoden, NaI und KI hingegen nicht. Interessanterweise induzierte Indol in den getesteten Konzentrationen keine Vakuolenbildung in B. xylophilus (Daten nicht gezeigt). Somit bestätigten die Ergebnisse, dass der Indol-Jod-Komplex für die Vakuolisierung und den Stoffwechsel von B. xylophilus verantwortlich ist.
Unter den auf nematizide Aktivität getesteten Indolen hatte 5-Iodindol den höchsten Slip-Index von -5,89 kcal/mol, gefolgt von 7-Iodindol (-4,48 kcal/mol), 4-Fluorindol (-4,33) und Indol (-4,03) (Abbildung 6). Die starke Wasserstoffbrücke im Rückgrat von 5-Iodindol an Leucin 218 stabilisiert dessen Bindung, während alle anderen Indolderivate über Wasserstoffbrücken in der Seitenkette an Serin 260 binden. Unter anderen modellierten Iodindolen hat 2-Iodindol einen Bindungswert von -5,248 kcal/mol, was auf seine Hauptwasserstoffbrücke mit Leucin 218 zurückzuführen ist. Andere bekannte Bindungen umfassen 3-Iodindol (-4,3 kcal/mol), 4-Iodindol (-4,0 kcal/mol) und 6-Fluorindol (-2,6 kcal/mol) (Ergänzende Abbildung S8). Die meisten halogenierten Indole und Indol selbst, mit Ausnahme von 5-Iodindol und 2-Iodindol, bilden eine Bindung mit Serin 260. Die Tatsache, dass Wasserstoffbrücken mit Leucin 218 auf eine effiziente Rezeptor-Liganden-Bindung hinweisen, wie sie bei Ivermectin beobachtet wurde (Ergänzende Abbildung S7), bestätigt, dass 5-Iodindol und 2-Iodindol, wie Ivermectin, über Leucin 218 fest an das aktive Zentrum des GluCL-Rezeptors binden (Abb. 6 und Ergänzende Abbildung S8). Wir gehen davon aus, dass diese Bindung erforderlich ist, um die offene Porenstruktur des GluCL-Komplexes aufrechtzuerhalten, und dass 5-Iodindol, 2-Iodindol, Avermectin und Ivermectin durch die feste Bindung an das aktive Zentrum des GluCL-Rezeptors den Ionenkanal offen halten und die Flüssigkeitsaufnahme ermöglichen.
Molekulares Andocken von Indol und halogeniertem Indol an GluCL. Bindungsorientierungen von (A) Indol-, (B) 4-Fluorindol-, (C) 7-Iodindol- und (D) 5-Iodindol-Liganden an das aktive Zentrum von GluCL. Das Protein wird durch ein Band dargestellt, die Wasserstoffbrücken im Proteinrückgrat sind als gelb gepunktete Linien dargestellt. (A′), (B′), (C′) und (D′) zeigen die Wechselwirkungen der entsprechenden Liganden mit den umgebenden Aminosäureresten, die Wasserstoffbrücken in den Seitenketten sind durch rosa gepunktete Pfeile gekennzeichnet.
Es wurden Experimente durchgeführt, um die toxische Wirkung von 5-Iodoindol auf die Keimung von Kohl- und Rettichsamen zu untersuchen. 5-Iodoindol (0,05 oder 0,1 mM) oder Avermectin (10 μg/ml) hatten wenig oder keine Wirkung auf die anfängliche Keimung und das Auflaufen der Pflänzchen (Abbildung 7). Darüber hinaus wurde kein signifikanter Unterschied zwischen der Keimrate unbehandelter Kontrollgruppen und der mit 5-Iodoindol oder Avermectin behandelten Samen festgestellt. Die Wirkung auf das Wachstum der Pfahlwurzel und die Anzahl der gebildeten Seitenwurzeln war unbedeutend, obwohl 1 mM (das Zehnfache der aktiven Konzentration) 5-Iodoindol die Entwicklung der Seitenwurzeln leicht verzögerte. Diese Ergebnisse zeigen, dass 5-Iodoindol für Pflanzenzellen ungiftig ist und in den untersuchten Konzentrationen die Pflanzenentwicklungsprozesse nicht stört.
Einfluss von 5-Iodindol auf die Samenkeimung. Keimung, Sprießen und seitliche Wurzelbildung von B. oleracea- und R. raphanistrum-Samen auf Murashige- und Skoog-Agarmedium mit oder ohne Avermectin oder 5-Iodindol. Die Keimung wurde nach dreitägiger Inkubation bei 22 °C dokumentiert.
Diese Studie berichtet über mehrere Fälle, in denen Indole Nematoden abtöteten. Besonders hervorzuheben ist, dass dies der erste Bericht über die Methylierung von Kiefernnadeln durch Iodoindol ist (ein Prozess, der durch die Ansammlung kleiner Vakuolen entsteht, die sich allmählich zu riesigen Vakuolen zusammenschließen und schließlich zum Membranbruch und zum Absterben führen). Iodoindol weist dabei signifikante nematizide Eigenschaften auf, die denen des kommerziellen Nematizids Avermectin ähneln.
Es wurde bereits berichtet, dass Indole in Prokaryoten und Eukaryoten mehrere Signalfunktionen ausüben, darunter die Hemmung/Bildung von Biofilmen, das Überleben von Bakterien und ihre Pathogenität19,32,33,34. Die potenziellen therapeutischen Wirkungen von halogenierten Indolen, Indolalkaloiden und halbsynthetischen Indolderivaten haben in jüngster Zeit großes Forschungsinteresse geweckt35,36,37. Beispielsweise wurde gezeigt, dass halogenierte Indole persistente Escherichia coli- und Staphylococcus aureus-Zellen abtöten37. Darüber hinaus ist es von wissenschaftlichem Interesse, die Wirksamkeit halogenierter Indole gegen andere Arten, Gattungen und Reiche zu untersuchen, und diese Studie ist ein Schritt in diese Richtung.
Wir schlagen hier einen Mechanismus für die durch 5-Iodoindol induzierte Letalität in C. elegans vor, der auf reversibler Zellschädigung (RCI) und Methylierung basiert (Abbildungen 4C und 5). Ödematöse Veränderungen wie Schwellungen und Vakuolendegeneration sind Indikatoren für RCI und Methylierung und manifestieren sich als riesige Vakuolen im Zytoplasma48,49. RCI stört die Energieproduktion, indem es die ATP-Produktion reduziert, einen Ausfall der ATPase-Pumpe verursacht oder Zellmembranen zerstört und einen schnellen Zustrom von Na+, Ca2+ und Wasser auslöst50,51,52. Intrazytoplasmatische Vakuolen entstehen in tierischen Zellen durch Flüssigkeitsansammlung im Zytoplasma aufgrund des Zustroms von Ca2+ und Wasser53. Interessanterweise ist dieser Mechanismus der Zellschädigung reversibel, wenn der Schaden vorübergehend ist und die Zellen für eine gewisse Zeit mit der ATP-Produktion beginnen. Bleibt der Schaden jedoch bestehen oder verschlimmert sich, sterben die Zellen ab.54 Unsere Beobachtungen zeigen, dass mit 5-Iodoindol behandelte Fadenwürmer nach Belastung mit Stressbedingungen nicht in der Lage sind, die normale Biosynthese wiederherzustellen.
Der durch 5-Iodoindol induzierte Methylierungsphänotyp in B. xylophilus kann auf das Vorhandensein von Iod und seine molekulare Verteilung zurückzuführen sein, da 7-Iodoindol eine weniger hemmende Wirkung auf B. xylophilus hatte als 5-Iodoindol (Tabelle 1 und ergänzende Abbildung S6). Diese Ergebnisse stimmen teilweise mit den Studien von Maltese et al. (2014) überein, die berichteten, dass die Translokation des Pyridylstickstoffrests in Indol von der Para- in die Meta-Position Vakuolisierung, Wachstumshemmung und Zytotoxizität in U251-Zellen aufhob, was darauf hindeutet, dass die Interaktion des Moleküls mit einem spezifischen aktiven Zentrum im Protein entscheidend ist27,44,45. Die in dieser Studie beobachteten Wechselwirkungen zwischen Indol oder halogenierten Indolen und GluCL-Rezeptoren stützen diese Annahme ebenfalls, da 5- und 2-Iodindol stärker an GluCL-Rezeptoren binden als die anderen untersuchten Indole (Abbildung 6 und ergänzende Abbildung S8). Das Iod an der zweiten oder fünften Position des Indols bindet über Wasserstoffbrücken im Rückgrat an Leucin 218 des GluCL-Rezeptors, während andere halogenierte Indole und Indol selbst schwache Wasserstoffbrücken in der Seitenkette mit Serin 260 bilden (Abbildung 6). Wir spekulieren daher, dass die Lokalisierung des Halogens eine wichtige Rolle bei der Induktion der Vakuolendegeneration spielt, während die starke Bindung von 5-Iodindol den Ionenkanal offen hält und dadurch einen schnellen Flüssigkeitseinstrom und Vakuolenriss ermöglicht. Der genaue Wirkungsmechanismus von 5-Iodindol muss jedoch noch bestimmt werden.
Vor der praktischen Anwendung von 5-Iodindol sollte seine toxische Wirkung auf Pflanzen analysiert werden. Unsere Keimungsexperimente zeigten, dass 5-Iodindol in den untersuchten Konzentrationen keinen negativen Einfluss auf die Keimung oder nachfolgende Entwicklungsprozesse hatte (Abbildung 7). Somit liefert diese Studie eine Grundlage für den Einsatz von 5-Iodindol im ökologischen Umfeld, um die Schädlichkeit von Kiefernnematoden für Kiefern zu kontrollieren.
Frühere Berichte haben gezeigt, dass die Indol-basierte Therapie einen potenziellen Ansatz zur Lösung des Problems der Antibiotikaresistenz und des Krebswachstums darstellt55. Darüber hinaus wirken Indole antibakteriell, krebshemmend, antioxidativ, entzündungshemmend, antidiabetisch, antiviral, antiproliferativ und tuberkulosehemmend und könnten eine vielversprechende Grundlage für die Arzneimittelentwicklung darstellen56,57. Diese Studie legt erstmals die mögliche Verwendung von Jod als Antiparasitikum und Anthelminthikum nahe.
Avermectin wurde vor drei Jahrzehnten entdeckt und 2015 mit dem Nobelpreis ausgezeichnet. Seine Anwendung als Anthelminthikum ist weiterhin aktiv. Aufgrund der raschen Entwicklung von Resistenzen gegen Avermectine bei Fadenwürmern und Schadinsekten ist jedoch eine alternative, kostengünstige und umweltfreundliche Strategie zur Bekämpfung des Kiefernfadenwurmbefalls erforderlich. Diese Studie beschreibt außerdem den Mechanismus, durch den 5-Iodoindol Kiefernfadenwürmer abtötet, und zeigt, dass 5-Iodoindol eine geringe Toxizität für Pflanzenzellen aufweist, was gute Aussichten für seine zukünftige kommerzielle Anwendung eröffnet.
Alle Experimente wurden vom Ethikkomitee der Yeungnam-Universität, Gyeongsan, Korea, genehmigt und die Methoden wurden gemäß den Richtlinien des Ethikkomitees der Yeungnam-Universität durchgeführt.
Die Eierinkubationsexperimente wurden nach etablierten Verfahren durchgeführt43. Zur Bestimmung der Schlupfraten (HR) wurden eintägige adulte Fadenwürmer (ca. 100 Weibchen und 100 Männchen) in Petrischalen mit dem Pilz überführt und 24 Stunden lang wachsen gelassen. Anschließend wurden die Eier isoliert und mit 5-Iodindol (0,05 mM und 0,1 mM) oder Avermectin (10 μg/ml) als Suspension in sterilem destilliertem Wasser behandelt. Diese Suspensionen (500 μl; ca. 100 Eier) wurden in die Vertiefungen einer 24-Well-Gewebekulturplatte überführt und bei 22 °C inkubiert. Nach 24 Stunden Inkubation wurden L2-Zählungen durchgeführt; die Zellen galten als tot, wenn sie sich bei Stimulation mit einem feinen Platindraht nicht bewegten. Dieses Experiment wurde in zwei Phasen mit jeweils sechs Wiederholungen durchgeführt. Die Daten aus beiden Experimenten wurden zusammengefasst und präsentiert. Die prozentuale HR wird wie folgt berechnet:
Die Larvenmortalität wurde anhand zuvor entwickelter Verfahren ermittelt. Nematodeneier wurden gesammelt und Embryonen durch Ausbrüten in sterilem destilliertem Wasser synchronisiert, um Larven im L2-Stadium zu erzeugen. Die synchronisierten Larven (ca. 500 Nematoden) wurden mit 5-Iodoindol (0,05 mM und 0,1 mM) oder Avermectin (10 μg/ml) behandelt und auf B. cinerea-Petrischalen gezüchtet. Nach 48-stündiger Inkubation bei 22 °C wurden die Nematoden in sterilem destilliertem Wasser gesammelt und auf das Vorhandensein der Stadien L2, L3 und L4 untersucht. Das Vorhandensein der Stadien L3 und L4 deutete auf eine Larventransformation hin, während das Vorhandensein des L2-Stadiums keine Transformation anzeigte. Die Bilder wurden mit dem iRiS™ Digital Cell Imaging System aufgenommen. Dieses Experiment wurde in zwei Phasen mit jeweils sechs Wiederholungen durchgeführt. Die Daten aus beiden Experimenten wurden kombiniert und präsentiert.
Die Toxizität von 5-Iodindol und Avermectin für Samen wurde mithilfe von Keimungstests auf Murashige- und Skoog-Agarplatten untersucht.62 B. oleracea- und R. raphanistrum-Samen wurden zunächst einen Tag lang in sterilem destilliertem Wasser eingeweicht, mit 1 ml 100%igem Ethanol gewaschen, 15 Minuten lang mit 1 ml 50%igem handelsüblichem Bleichmittel (3 % Natriumhypochlorit) sterilisiert und fünfmal mit 1 ml sterilem Wasser gewaschen. Die sterilisierten Samen wurden dann auf Keimungs-Agarplatten gedrückt, die 0,86 g/l (0,2X) Murashige- und Skoog-Medium und 0,7 % bakteriologisches Agar mit oder ohne 5-Iodindol oder Avermectin enthielten. Die Platten wurden dann bei 22 °C inkubiert, und nach drei Tagen Inkubation wurden Bilder aufgenommen. Dieses Experiment wurde in zwei Phasen mit jeweils sechs Wiederholungen durchgeführt.
Veröffentlichungszeit: 26. Februar 2025