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Fungizide werden häufig während der Blütezeit von Obstbäumen eingesetzt und können bestäubende Insekten gefährden. Es ist jedoch wenig darüber bekannt, wie Nicht-Bienen-Bestäuber (z. B. Solitärbienen, Osmia cornifrons) auf Kontakt- und systemische Fungizide reagieren, die üblicherweise während der Blüte bei Äpfeln verwendet werden. Diese Wissenslücke schränkt behördliche Entscheidungen zur Festlegung sicherer Konzentrationen und Zeitpunkte von Fungizidspritzungen ein. Wir untersuchten die Auswirkungen von zwei Kontaktfungiziden (Captan und Mancozeb) und vier Interlayer-/Phytosystem-Fungiziden (Ciprocyclin, Myclobutanil, Pyrostrobin und Trifloxystrobin). Auswirkungen auf Gewichtszunahme, Überleben, Geschlechterverhältnis und Bakterienvielfalt der Larven. Die Bewertung wurde mithilfe eines chronischen oralen Bioassays durchgeführt, bei dem Pollen in drei Dosen behandelt wurde, basierend auf der derzeit empfohlenen Dosis für die Feldanwendung (1X), halber Dosis (0,5X) und niedriger Dosis (0,1X). Alle Dosen von Mancozeb und Pyritisolin reduzierten das Körpergewicht und das Überleben der Larven signifikant. Anschließend sequenzierten wir das 16S-Gen, um das Larvenbakteriom von Mancozeb, dem Fungizid mit der höchsten Mortalitätsrate, zu charakterisieren. Wir stellten fest, dass die Bakterienvielfalt und -häufigkeit bei Larven, die mit Mancozeb-behandeltem Pollen gefüttert wurden, signifikant reduziert waren. Unsere Laborergebnisse deuten darauf hin, dass das Versprühen einiger dieser Fungizide während der Blütezeit besonders schädlich für die Gesundheit von O. cornifrons ist. Diese Informationen sind relevant für zukünftige Managemententscheidungen zum nachhaltigen Einsatz von Obstbaumschutzmitteln und dienen als Grundlage für Regulierungsprozesse zum Schutz von Bestäubern.
Die Solitär-Mauerbiene Osmia cornifrons (Hymenoptera: Megachilidae) wurde Ende der 1970er- und Anfang der 1980er-Jahre aus Japan in die USA eingeführt und spielt seither eine wichtige Bestäuberrolle in bewirtschafteten Ökosystemen. Eingebürgerte Populationen dieser Biene sind Teil von etwa 50 Wildbienenarten, die die Bienen ergänzen, die in den USA Mandel- und Apfelplantagen bestäuben2,3. Mauerbienen sind mit zahlreichen Herausforderungen konfrontiert, darunter Lebensraumfragmentierung, Krankheitserreger und Pestizide3,4. Unter den Insektiziden verringern Fungizide die Energieaufnahme, die Nahrungssuche5 und die Körperkondition6,7. Obwohl neuere Forschungsergebnisse darauf hindeuten, dass die Gesundheit von Mauerbienen direkt von kommensalen und ektobaktischen Mikroorganismen beeinflusst wird,8,9 da Bakterien und Pilze die Ernährung und Immunreaktionen beeinflussen können, werden die Auswirkungen des Kontakts mit Fungiziden auf die mikrobielle Vielfalt von Mauerbienen gerade erst erforscht.
Fungizide mit unterschiedlicher Wirkung (Kontakt- und systemische Wirkung) werden in Obstgärten vor und während der Blüte versprüht, um Krankheiten wie Apfelschorf, Bitterfäule, Braunfäule und Echten Mehltau zu behandeln10,11. Fungizide gelten als unschädlich für Bestäuber und werden daher Gärtnern während der Blütezeit empfohlen. Der Kontakt mit diesen Fungiziden und ihre Aufnahme durch Bienen sind relativ gut erforscht, da sie Teil des Pestizid-Registrierungsprozesses der US-Umweltschutzbehörde und vieler anderer nationaler Aufsichtsbehörden sind12,13,14. Die Auswirkungen von Fungiziden auf Nicht-Bienen sind jedoch weniger bekannt, da sie in den USA gemäß den Zulassungsvereinbarungen nicht vorgeschrieben sind15. Darüber hinaus gibt es im Allgemeinen keine standardisierten Protokolle für Tests an einzelnen Bienen16,17, und die Haltung von Kolonien, die Bienen für Tests bereitstellen, ist eine Herausforderung18. In Europa und den USA werden zunehmend Versuche mit verschiedenen Arten von Nutzbienen durchgeführt, um die Auswirkungen von Pestiziden auf Wildbienen zu untersuchen. Für O. cornifrons wurden vor kurzem standardisierte Protokolle entwickelt19.
Hornbienen sind Monozyten und werden kommerziell in der Karpfenzucht als Ergänzung oder Ersatz für Honigbienen eingesetzt. Diese Bienen schlüpfen zwischen März und April, wobei die frühreifen Männchen drei bis vier Tage vor den Weibchen schlüpfen. Nach der Paarung sammelt das Weibchen aktiv Pollen und Nektar, um eine Reihe von Brutzellen in der röhrenförmigen Nesthöhle (natürlich oder künstlich) zu bilden1,20. Die Eier werden auf Pollen in den Zellen abgelegt; das Weibchen baut anschließend eine Lehmwand, bevor es die nächste Zelle vorbereitet. Die Larven des ersten Stadiums sind im Chorion eingeschlossen und ernähren sich von Embryoflüssigkeiten. Vom zweiten bis zum fünften Stadium (Vorpuppe) ernähren sich die Larven von Pollen22. Sobald der Pollenvorrat vollständig erschöpft ist, verpuppen sich die Larven und schlüpfen als adulte Tiere in derselben Brutkammer, üblicherweise im Spätsommer20,23. Die adulten Tiere schlüpfen im folgenden Frühjahr. Das Überleben der adulten Tiere hängt von der Nettoenergiezunahme (Gewichtszunahme) ab, die auf der Nahrungsaufnahme basiert. Daher sind die Nährstoffqualität des Pollens sowie andere Faktoren wie das Wetter oder die Belastung mit Pestiziden ausschlaggebende Faktoren für Überleben und Gesundheit24.
Vor der Blüte ausgebrachte Insektizide und Fungizide können sich in unterschiedlichem Ausmaß im Gefäßsystem der Pflanze bewegen, von translaminar (z. B. können sie sich von der Oberseite der Blätter zur Unterseite bewegen, wie manche Fungizide) 25 bis hin zu wirklich systemischen Effekten. , die von den Wurzeln aus in die Krone eindringen können, können in den Nektar von Apfelblüten gelangen 26, wo sie erwachsene O. cornifrons töten können 27. Einige Pestizide gelangen auch in den Pollen, beeinträchtigen die Entwicklung der Maislarven und führen zu deren Tod 19. Andere Studien haben gezeigt, dass manche Fungizide das Nistverhalten der verwandten Art O. lignaria signifikant verändern können 28. Außerdem haben Labor- und Feldstudien, die Szenarien der Pestizidexposition (einschließlich Fungizide) simulierten, gezeigt, dass Pestizide die Physiologie 22, Morphologie 29 und das Überleben von Honigbienen und einigen Solitärbienen negativ beeinflussen. Verschiedene fungizide Sprays, die während der Blüte direkt auf die geöffneten Blüten aufgetragen werden, können den von den erwachsenen Tieren für die Larvenentwicklung gesammelten Pollen kontaminieren. Die Auswirkungen müssen noch untersucht werden30.
Es wird zunehmend anerkannt, dass die Larvenentwicklung durch Pollen und mikrobielle Gemeinschaften des Verdauungssystems beeinflusst wird. Das Mikrobiom der Honigbiene beeinflusst Parameter wie Körpermasse31, Stoffwechselveränderungen22 und die Anfälligkeit für Krankheitserreger32. Frühere Studien untersuchten den Einfluss von Entwicklungsstadium, Nährstoffen und Umwelt auf das Mikrobiom von Solitärbienen. Diese Studien zeigten Ähnlichkeiten in der Struktur und Häufigkeit des Larven- und Pollenmikrobioms33 sowie der häufigsten Bakteriengattungen Pseudomonas und Delftia bei Solitärbienenarten. Obwohl Fungizide mit Strategien zum Schutz der Bienengesundheit in Verbindung gebracht wurden, sind die Auswirkungen von Fungiziden auf die Larvenmikrobiota durch direkte orale Exposition noch unerforscht.
In dieser Studie wurden die Auswirkungen praxisnaher Dosen von sechs häufig verwendeten Fungiziden, die für den Einsatz an Obstbäumen in den USA zugelassen sind, untersucht. Dazu gehörten Kontakt- und systemische Fungizide, die Larven des Maisschwärmers aus kontaminierten Lebensmitteln oral verabreicht wurden. Wir fanden heraus, dass Kontakt- und systemische Fungizide die Gewichtszunahme der Bienen verringerten und die Sterblichkeit erhöhten, wobei die schwerwiegendsten Auswirkungen mit Mancozeb und Pyrithiopid in Zusammenhang standen. Anschließend verglichen wir die mikrobielle Diversität der Larven, die mit Mancozeb-behandeltem Pollenfutter gefüttert wurden, mit denen der Kontrollgruppe. Wir diskutieren mögliche Mechanismen, die der Sterblichkeit zugrunde liegen, und die Auswirkungen auf Programme zum integrierten Schädlings- und Bestäubermanagement (IPPM)36.
Ausgewachsene O. cornifrons, die in Kokons überwintern, wurden vom Fruit Research Center, Biglerville, PA, bezogen und bei −3 bis 2 °C (±0,3 °C) gelagert. Vor dem Experiment (insgesamt 600 Kokons). Im Mai 2022 wurden täglich 100 O. cornifrons-Kokons in Plastikbecher überführt (50 Kokons pro Becher, DI 5 cm × 15 cm lang) und Tücher wurden in die Becher gelegt, um das Öffnen zu fördern und ein kaubares Substrat bereitzustellen, wodurch der Stress für die Steinbienen reduziert wurde37. Stellen Sie zwei Plastikbecher mit Kokons in einen Insektenkäfig (30 × 30 × 30 cm, BugDorm MegaView Science Co. Ltd., Taiwan) mit 10 ml-Futtertrögen mit 50 %iger Saccharoselösung und lagern Sie sie vier Tage lang, um das Verschließen und die Paarung sicherzustellen. 23 °C, relative Luftfeuchtigkeit 60 %, Photoperiode 10 l (geringe Intensität): 14 Tage. 100 verpaarte Weibchen und Männchen wurden sechs Tage lang jeden Morgen (100 pro Tag) während der Blütezeit der Apfelbäume in zwei künstliche Nester entlassen (Fallennest: Breite 33,66 × Höhe 30,48 × Länge 46,99 cm; ergänzende Abbildung 1). Platziert im Pennsylvania State Arboretum, in der Nähe von Kirsche (Prunus cerasus 'Eubank' Sweet Cherry Pie™), Pfirsich (Prunus persica 'Contender'), Prunus persica 'PF 27A' Flamin Fury®), Birne (Pyrus perifolia 'Olympic', Pyrus perifolia 'Shinko', Pyrus perifolia 'Shinseiki'), Coronaria-Apfelbaum (Malus coronaria) und zahlreichen Apfelbaumsorten (Malus coronaria, Malus), einheimischem Apfelbaum 'Co-op 30' Enterprise™, Malus-Apfelbaum 'Co-Op 31' Winecrisp™, Begonie 'Freedom', Begonie 'Golden Delicious', Begonie 'Nova Spy'). Jedes blaue Vogelhäuschen aus Kunststoff passt auf zwei Holzkisten. Jeder Nistkasten enthielt 800 leere Kraftpapierröhren (spiralförmig geöffnet, 0,8 cm Innendurchmesser × 15 cm Länge) (Jonesville Paper Tube Co., Michigan), die in undurchsichtige Zellophanröhren (0,7 Zoll Außendurchmesser, siehe Plastikstopfen (T-1X-Stopfen)) eingesetzt waren, die als Nistplätze dienten.
Beide Nistkästen waren nach Osten ausgerichtet und mit einem grünen Gartenzaun aus Kunststoff (Everbilt Modell Nr. 889250EB12, Öffnungsgröße 5 × 5 cm, 0,95 m × 100 m) abgedeckt, um Nagetiere und Vögel am Zugang zu hindern, und wurden auf die Erdoberfläche neben den Erdkästen des Nistkastens gestellt. Nistkasten (Ergänzende Abbildung 1a). Maiszünslereier wurden täglich gesammelt, indem 30 Röhrchen aus den Nestern entnommen und ins Labor transportiert wurden. Machen Sie mit einer Schere einen Schnitt am Ende des Röhrchens und zerlegen Sie dann das Spiralröhrchen, um die Brutzellen freizulegen. Einzelne Eier und ihr Pollen wurden mit einem gebogenen Spatel (Microslide-Toolkit, BioQuip Products Inc., Kalifornien) entfernt. Die Eier wurden auf feuchtem Filterpapier inkubiert und 2 Stunden lang in eine Petrischale gelegt, bevor sie in unseren Experimenten verwendet wurden (Ergänzende Abbildung 1b-d).
Im Labor untersuchten wir die orale Toxizität von sechs Fungiziden, die vor und während der Apfelblüte in drei Konzentrationen (0,1X, 0,5X und 1X, wobei 1X die Markierung pro 100 Gallonen Wasser/Acre ist. Hohe Felddosis = Konzentration im Feld). , Tabelle 1). Jede Konzentration wurde 16-mal wiederholt (n = 16). Zwei Kontaktfungizide (Tabelle S1: Mancozeb 2696,14 ppm und Captan 2875,88 ppm) und vier systemische Fungizide (Tabelle S1: Pyrithiostrobin 250,14 ppm; Trifloxystrobin 110,06 ppm; Myclobutanilazol 75,12 ppm; Cyprodinil 280,845 ppm) zeigten eine Toxizität gegenüber Obst, Gemüse und Zierpflanzen. Wir homogenisierten den Pollen mit einem Zerkleinerer, gaben 0,20 g in eine Vertiefung (Falcon-Platte mit 24 Vertiefungen) und fügten 1 μl Fungizidlösung hinzu und vermischten es, um pyramidenförmigen Pollen mit 1 mm tiefen Vertiefungen zu bilden, in die wir die Eier legten. Zum Platzieren verwendeten wir einen Minispatel (Ergänzende Abbildung 1c,d). Die Falcon-Platten wurden bei Raumtemperatur (25 °C) und 70 % relativer Luftfeuchtigkeit gelagert. Wir verglichen sie mit Kontrolllarven, die mit einer homogenen Pollendiät gefüttert und mit reinem Wasser behandelt wurden. Wir zeichneten die Mortalität auf und maßen das Larvengewicht jeden zweiten Tag, bis die Larven das vorpuppenalter erreichten. Dazu verwendeten wir eine Analysenwaage (Fisher Scientific, Genauigkeit = 0,0001 g). Schließlich wurde das Geschlechterverhältnis durch Öffnen des Kokons nach 2,5 Monaten bestimmt.
DNA wurde aus ganzen O. cornifrons-Larven extrahiert (n = 3 pro Behandlungsbedingung, mit Mancozeb behandelter und unbehandelter Pollen) und wir führten an diesen Proben mikrobielle Diversitätsanalysen durch, insbesondere weil bei Mancozeb die höchste Sterblichkeit bei Larven beobachtet wurde, die MnZn erhielten. DNA wurde amplifiziert, mit dem DNAZymoBIOMICS®-96 MagBead DNA-Kit (Zymo Research, Irvine, CA) gereinigt und auf einem Illumina® MiSeq™ mit dem v3-Kit sequenziert (600 Zyklen). Die gezielte Sequenzierung bakterieller 16S-ribosomaler RNA-Gene wurde mit dem Quick-16S™ NGS Library Prep Kit (Zymo Research, Irvine, CA) unter Verwendung von Primern durchgeführt, die auf die V3-V4-Region des 16S-rRNA-Gens abzielen. Zusätzlich wurde eine 18S-Sequenzierung unter Verwendung von 10 % PhiX-Einschluss durchgeführt und die Amplifikation wurde unter Verwendung des Primerpaars 18S001 und NS4 durchgeführt.
Importieren und verarbeiten Sie gepaarte Reads39 mithilfe der QIIME2-Pipeline (v2022.11.1). Diese Reads wurden gekürzt und zusammengeführt, und chimäre Sequenzen wurden mithilfe des DADA2-Plugins in QIIME2 (qiime dada2 noise pairing)40 entfernt. Die 16S- und 18S-Klassenzuordnungen erfolgten mithilfe des Objektklassifizierer-Plugins Classify-sklearn und des vortrainierten Artefakts silva-138-99-nb-classifier.
Alle experimentellen Daten wurden auf Normalität (Shapiro-Wilks) und Homogenität der Varianzen (Levene-Test) überprüft. Da der Datensatz die Annahmen der parametrischen Analyse nicht erfüllte und die Transformation die Residuen nicht standardisieren konnte, führten wir eine nichtparametrische zweifaktorielle ANOVA (Kruskal-Wallis) mit zwei Faktoren [Zeit (dreiphasige Zeitpunkte von 2, 5 und 8 Tagen) und Fungizid] durch, um die Wirkung der Behandlung auf das Frischgewicht der Larven zu bewerten; anschließend wurden post hoc nichtparametrische paarweise Vergleiche mithilfe des Wilcoxon-Tests durchgeführt. Wir verwendeten ein verallgemeinertes lineares Modell (GLM) mit einer Poisson-Verteilung, um die Wirkung von Fungiziden auf das Überleben bei drei Fungizidkonzentrationen zu vergleichen41,42. Für die Analyse der differentiellen Häufigkeit wurde die Anzahl der Amplikonsequenzvarianten (ASVs) auf Gattungsebene reduziert. Vergleiche der differentiellen Häufigkeit zwischen Gruppen mit 16S (Gattungsebene) und 18S relativer Häufigkeit wurden mithilfe eines verallgemeinerten additiven Modells für Position, Maßstab und Form (GAMLSS) mit Beta-Null-inflationären (BEZI) Familienverteilungen durchgeführt, die auf einem Makromodell in Microbiome R43 (v1.1) modelliert wurden. 1). Mitochondriale und Chloroplastenarten wurden vor der differentiellen Analyse entfernt. Aufgrund der unterschiedlichen taxonomischen Ebenen von 18S wurde nur die niedrigste Ebene jedes Taxons für die differentiellen Analysen verwendet. Alle statistischen Analysen wurden mit R (v. 3.4.3., CRAN-Projekt) durchgeführt (Team 2013).
Die Exposition gegenüber Mancozeb, Pyrithiostrobin und Trifloxystrobin reduzierte die Gewichtszunahme von O. cornifrons signifikant (Abb. 1). Diese Effekte wurden bei allen drei untersuchten Dosierungen konsistent beobachtet (Abb. 1a–c). Cyclostrobin und Myclobutanil reduzierten das Gewicht der Larven nicht signifikant.
Durchschnittliches Frischgewicht der Stängelbohrerlarven, gemessen zu drei Zeitpunkten unter vier Diätbehandlungen (homogene Pollenfütterung + Fungizid: Kontrolle, 0,1-fache, 0,5-fache und 1-fache Dosis). (a) Niedrige Dosis (0,1-fache): erster Zeitpunkt (Tag 1): χ2: 30,99, DF = 6; P < 0,0001, zweiter Zeitpunkt (Tag 5): 22,83, DF = 0,0009; dritter Zeitpunkt (Tag 8): χ2: 28,39, DF = 6; (b) halbe Dosis (0,5-fache): erster Zeitpunkt (Tag 1): χ2: 35,67, DF = 6; P < 0,0001, zweiter Zeitpunkt (Tag 1): χ2: 15,98, DF = 6; P = 0,0090; dritter Zeitpunkt (Tag 8) χ2: 16,47, DF = 6; (c) Stelle oder volle Dosis (1X): erster Zeitpunkt (Tag 1) χ2: 20,64, P = 6; P = 0,0326, zweiter Zeitpunkt (Tag 5): χ2: 22,83, DF = 6; P = 0,0009; dritter Zeitpunkt (Tag 8): χ2: 28,39, DF = 6; nichtparametrische Varianzanalyse. Balken stellen Mittelwert ± SE der paarweisen Vergleiche dar (α = 0,05) (n = 16) *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,001, ***P ≤ 0,0001.
Bei der niedrigsten Dosis (0,1X) reduzierte sich das Körpergewicht der Larven mit Trifloxystrobin um 60 %, mit Mancozeb um 49 %, mit Myclobutanil um 48 % und mit Pyrithiostrobin um 46 % (Abb. 1a). Bei der halben Felddosis (0,5X) reduzierte sich das Körpergewicht der Mancozeb-Larven um 86 %, mit Pyrithiostrobin um 52 % und mit Trifloxystrobin um 50 % (Abb. 1b). Eine volle Felddosis (1X) Mancozeb reduzierte das Larvengewicht um 82 %, mit Pyrithiostrobin um 70 % und mit Trifloxystrobin, Myclobutanil und Sangard um etwa 30 % (Abb. 1c).
Die Sterblichkeit war bei Larven, die mit Mancozeb-Pollen gefüttert wurden, am höchsten, gefolgt von Pyrithiostrobin und Trifloxystrobin. Die Sterblichkeit stieg mit steigenden Mancozeb- und Pyritisolin-Dosen (Abb. 2; Tabelle 2). Die Sterblichkeit des Maiszünslers nahm jedoch mit steigenden Trifloxystrobin-Konzentrationen nur geringfügig zu; Cyprodinil und Captan erhöhten die Sterblichkeit im Vergleich zu Kontrollbehandlungen nicht signifikant.
Die Mortalität von Borerfliegenlarven nach Aufnahme von Pollen, der mit sechs verschiedenen Fungiziden behandelt worden war, wurde verglichen. Mancozeb und Pentopyramid reagierten empfindlicher auf orale Exposition gegenüber Maismaden (GLM: χ = 29,45, DF = 20, P = 0,0059) (Gerade, Steigung = 0,29, P < 0,001; Steigung = 0,24, P < 0,00)).
Im Durchschnitt aller Behandlungen waren 39,05 % der Patienten weiblich und 60,95 % männlich. In den Kontrollgruppen betrug der Frauenanteil sowohl in den Studien mit niedriger (0,1-facher) als auch mit halber (0,5-facher) Dosis 40 % und in den Studien mit Felddosis (1-facher) Dosis 30 %. Bei der 0,1-fachen Dosis waren unter den pollengefütterten Larven, die mit Mancozeb und Myclobutanil behandelt wurden, 33,33 % der adulten Larven weiblich, 22 % der adulten Larven weiblich, 44 % der adulten Larven weiblich, 41 % der adulten Larven weiblich und 31 % der Kontrollgruppen (Abb. 3a). Bei der 0,5-fachen Dosis waren 33 % der adulten Würmer in der Mancozeb- und Pyrithiostrobin-Gruppe weiblich, 36 % in der Trifloxystrobin-Gruppe, 41 % in der Myclobutanil-Gruppe und 46 % in der Cyprostrobin-Gruppe. In der Captan-Gruppe lag dieser Wert bei 53 % und in der Kontrollgruppe bei 38 % (Abb. 3b). Bei der 1-fachen Dosis waren 30 % der Mancozeb-Gruppe weiblich, 36 % der Pyrithiostrobin-Gruppe, 44 % der Trifloxystrobin-Gruppe, 38 % der Myclobutanil-Gruppe und 50 % der Kontrollgruppe – 38,5 % (Abb. 3c).
Prozentsatz weiblicher und männlicher Bohrer nach Fungizidexposition im Larvenstadium. (a) Niedrige Dosis (0,1X). (b) Halbe Dosis (0,5X). (c) Felddosis oder volle Dosis (1X).
Die 16S-Sequenzanalyse zeigte, dass sich die Bakteriengruppe zwischen Larven, die mit Mancozeb-behandeltem Pollen gefüttert wurden, und Larven, die mit unbehandeltem Pollen gefüttert wurden, unterschied (Abb. 4a). Der mikrobielle Index der unbehandelten Larven, die mit Pollen gefüttert wurden, war höher als der der Larven, die mit Mancozeb-behandeltem Pollen gefüttert wurden (Abb. 4b). Obwohl der beobachtete Unterschied im Reichtum zwischen den Gruppen nicht statistisch signifikant war, war er deutlich niedriger als der bei Larven, die sich von unbehandeltem Pollen ernährten (Abb. 4c). Die relative Häufigkeit zeigte, dass die Mikrobiota der mit Kontrollpollen gefütterten Larven vielfältiger war als die der Larven, die mit Mancozeb-behandelten Larven gefüttert wurden (Abb. 5a). Die deskriptive Analyse ergab das Vorhandensein von 28 Gattungen in Kontroll- und Mancozeb-behandelten Proben (Abb. 5b). c Die Analyse mittels 18S-Sequenzierung ergab keine signifikanten Unterschiede (Ergänzende Abbildung 2).
SAV-Profile basierend auf 16S-Sequenzen wurden mit der Shannon-Reichtumsdichte und der beobachteten Reichhaltigkeit auf Phylumebene verglichen. (a) Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) basierend auf der Gesamtstruktur der mikrobiellen Gemeinschaft in unbehandelten, pollengefütterten oder Kontrolllarven (blau) sowie Mancozeb-gefütterten Larven (orange). Jeder Datenpunkt stellt eine separate Probe dar. Die PCoA wurde mithilfe der Bray-Curtis-Distanz der multivariaten t-Verteilung berechnet. Ovale stellen das 80%-Konfidenzniveau dar. (b) Boxplot, Rohdaten zur Shannon-Reichtumsdichte (Punkte) und c. Beobachtbare Reichhaltigkeit. Die Boxplots zeigen Boxen für Medianlinie, Interquartilsabstand (IQR) und 1,5 × IQR (n = 3).
Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaften von Larven, die mit Mancozeb-behandeltem und unbehandeltem Pollen gefüttert wurden. (a) Relative Häufigkeit mikrobieller Gattungen in Larven. (b) Heatmap der identifizierten mikrobiellen Gemeinschaften. Delftia (Odds Ratio (OR) = 0,67, P = 0,0030) und Pseudomonas (OR = 0,3, P = 0,0074), Microbacterium (OR = 0,75, P = 0,0617) (OR = 1,5, P = 0,0060); Heatmap-Zeilen werden anhand von Korrelationsdistanz und durchschnittlicher Konnektivität gruppiert.
Unsere Ergebnisse zeigen, dass die orale Gabe von Kontaktfungiziden (Mancozeb) und systemischen Fungiziden (Pyrostrobin und Trifloxystrobin), die während der Blütezeit häufig angewendet werden, die Gewichtszunahme der Maislarven signifikant verringerte und die Sterblichkeit erhöhte. Darüber hinaus verringerte Mancozeb die Diversität und den Reichtum des Mikrobioms im Vorpuppenstadium signifikant. Myclobutanil, ein weiteres systemisches Fungizid, reduzierte die Gewichtszunahme der Larven bei allen drei Dosierungen signifikant. Dieser Effekt war zum zweiten (Tag 5) und dritten (Tag 8) Zeitpunkt offensichtlich. Im Gegensatz dazu verringerten Cyprodinil und Captan die Gewichtszunahme oder das Überleben im Vergleich zur Kontrollgruppe nicht signifikant. Unseres Wissens ist dies die erste Arbeit, die die Auswirkungen verschiedener Feldmengen verschiedener Fungizide zum Schutz von Maispflanzen vor direkter Pollenexposition untersucht.
Alle Fungizidbehandlungen reduzierten die Gewichtszunahme im Vergleich zu Kontrollbehandlungen signifikant. Mancozeb hatte mit einer durchschnittlichen Reduktion von 51 % den größten Effekt auf die Gewichtszunahme der Larven, gefolgt von Pyrithiostrobin. Andere Studien berichteten jedoch nicht über negative Auswirkungen von Fungiziden in Felddosen auf die Larvenstadien44. Obwohl Dithiocarbamat-Biozide eine geringe akute Toxizität45 aufweisen, können Ethylenbisdithiocarbamate (EBDCS) wie Mancozeb zu Harnstoffethylensulfid abgebaut werden. Aufgrund seiner mutagenen Wirkung auf andere Tiere könnte dieses Abbauprodukt für die beobachteten Wirkungen verantwortlich sein46,47. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Bildung von Ethylenthioharnstoff durch Faktoren wie erhöhte Temperatur48, Luftfeuchtigkeit49 und Lagerdauer50 des Produkts beeinflusst wird. Sachgemäße Lagerbedingungen für Biozide können diese Nebenwirkungen mildern. Darüber hinaus hat die Europäische Behörde für Lebensmittelsicherheit Bedenken hinsichtlich der Toxizität von Pyrithiopid geäußert, das nachweislich krebserregend auf das Verdauungssystem anderer Tiere wirkt51.
Die orale Gabe von Mancozeb, Pyrithiostrobin und Trifloxystrobin erhöht die Mortalität von Maiszünslerlarven. Im Gegensatz dazu zeigten Myclobutanil, Ciprocyclin und Captan keinen Einfluss auf die Mortalität. Diese Ergebnisse unterscheiden sich von denen von Ladurner et al.52, die zeigten, dass Captan die Überlebensrate adulter O. lignaria und Apis mellifera L. (Hymenoptera, Apisidae) signifikant reduzierte. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Fungizide wie Captan und Boscalid Larvenmortalität52,53,54 verursachen oder das Fressverhalten55 verändern. Diese Veränderungen können wiederum die Nährstoffqualität des Pollens und letztendlich den Energiegewinn im Larvenstadium beeinträchtigen. Die in der Kontrollgruppe beobachtete Mortalität stimmte mit anderen Studien überein56,57.
Das in unserer Arbeit beobachtete, männchenbegünstigende Geschlechterverhältnis lässt sich möglicherweise durch Faktoren wie unzureichende Paarung und schlechte Wetterbedingungen während der Blütezeit erklären, wie bereits von Vicens und Bosch für O. cornuta vorgeschlagen. Obwohl Weibchen und Männchen in unserer Studie vier Tage Zeit hatten, sich zu paaren (ein Zeitraum, der allgemein als ausreichend für eine erfolgreiche Paarung angesehen wird), reduzierten wir die Lichtintensität bewusst, um Stress zu minimieren. Diese Änderung kann jedoch den Paarungsprozess unbeabsichtigt beeinträchtigen61. Darüber hinaus sind die Bienen mehrere Tage lang widrigem Wetter ausgesetzt, darunter Regen und niedrige Temperaturen (<5 °C), was den Paarungserfolg ebenfalls negativ beeinflussen kann4,23.
Obwohl sich unsere Studie auf das gesamte Larvenmikrobiom konzentrierte, bieten unsere Ergebnisse Einblicke in mögliche Beziehungen zwischen Bakteriengemeinschaften, die für die Ernährung der Bienen und die Fungizidbelastung entscheidend sein können. Beispielsweise wiesen Larven, die mit Mancozeb-behandeltem Pollen gefüttert wurden, eine signifikant reduzierte mikrobielle Gemeinschaftsstruktur und -häufigkeit auf als Larven, die unbehandelten Pollen gefüttert bekamen. Bei Larven, die unbehandelten Pollen fraßen, waren die Bakteriengruppen Proteobacteria und Actinobacteria dominant und hauptsächlich aerob oder fakultativ aerob. Delft-Bakterien, die üblicherweise mit solitären Bienenarten assoziiert werden, sind für ihre antibiotische Aktivität bekannt, was auf eine potenzielle Schutzfunktion gegen Krankheitserreger hindeutet. Eine andere Bakterienart, Pseudomonas, kam in Larven, die unbehandelten Pollen gefüttert wurden, häufig vor, war jedoch in mit Mancozeb behandelten Larven signifikant reduziert. Unsere Ergebnisse stützen frühere Studien, die Pseudomonas als eine der am häufigsten vorkommenden Gattungen in O. bicornis35 und anderen solitären Wespen34 identifizierten. Obwohl es keine experimentellen Beweise für die Rolle von Pseudomonas für die Gesundheit von O. cornifrons gibt, wurde gezeigt, dass dieses Bakterium die Synthese von Schutztoxinen im Käfer Paederus fuscipes fördert und den Argininstoffwechsel in vitro unterstützt 35, 65. Diese Beobachtungen weisen auf eine mögliche Rolle bei der Virus- und Bakterienabwehr während der Entwicklung der O. cornifrons-Larven hin. Microbacterium ist eine weitere in unserer Studie identifizierte Gattung, die Berichten zufolge in großen Mengen in Larven der Schwarzen Soldatenfliege unter Hungerbedingungen vorkommt66. In O. cornifrons-Larven können Mikrobakterien zum Gleichgewicht und zur Widerstandsfähigkeit des Darmmikrobioms unter Stressbedingungen beitragen. Außerdem kommt Rhodococcus in O. cornifrons-Larven vor und ist für seine entgiftenden Fähigkeiten bekannt67. Diese Gattung kommt auch im Darm von A. florea vor, jedoch in sehr geringer Häufigkeit68. Unsere Ergebnisse zeigen das Vorhandensein multipler genetischer Variationen in zahlreichen mikrobiellen Taxa, die Stoffwechselprozesse in Larven verändern können. Ein besseres Verständnis der funktionellen Diversität von O. cornifrons ist jedoch erforderlich.
Zusammenfassend deuten die Ergebnisse darauf hin, dass Mancozeb, Pyrithiostrobin und Trifloxystrobin die Gewichtszunahme der Maiszünslerlarven verringerten und die Sterblichkeit erhöhten. Obwohl die Besorgnis über die Auswirkungen von Fungiziden auf Bestäuber wächst, müssen die Auswirkungen der Restmetaboliten dieser Verbindungen besser verstanden werden. Diese Ergebnisse können in Empfehlungen für integrierte Bestäubermanagementprogramme einfließen, die Landwirten helfen, den Einsatz bestimmter Fungizide vor und während der Blüte von Obstbäumen zu vermeiden, indem sie Fungizide auswählen und den Anwendungszeitpunkt variieren oder die Verwendung weniger schädlicher Alternativen fördern 36. Diese Informationen sind wichtig für die Entwicklung von Empfehlungen zum Pestizideinsatz, wie z. B. die Anpassung bestehender Sprühprogramme und die Änderung des Sprühzeitpunkts bei der Auswahl von Fungiziden oder die Förderung der Verwendung weniger gefährlicher Alternativen. Die negativen Auswirkungen von Fungiziden auf das Geschlechterverhältnis, das Fressverhalten, das Darmmikrobiom und die molekularen Mechanismen, die dem Gewichtsverlust und der Sterblichkeit von Maiszünslern zugrunde liegen, müssen weiter erforscht werden.
Die Quelldaten 1, 2 und 3 in Abbildung 1 und 2 wurden im figshare-Datenrepository DOI: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24996245 und https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24996233 hinterlegt. Die in der vorliegenden Studie analysierten Sequenzen (Abb. 4, 5) sind im NCBI SRA-Repository unter der Zugangsnummer PRJNA1023565 verfügbar.
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Veröffentlichungszeit: 14. Mai 2024