Pflanzen- und Krankheitserregermaterial
Eine Sorghum-Assoziationskartierungspopulation, die sogenannte Sorghum-Konversionspopulation (SCP), wurde von Dr. Pat Brown an der University of Illinois (jetzt UC Davis) bereitgestellt. Sie wurde bereits beschrieben und besteht aus verschiedenen Linien, die auf Photoperiodenunempfindlichkeit und geringeren Wuchs umgestellt wurden, um das Wachstum und die Entwicklung der Pflanzen in US-amerikanischen Umgebungen zu fördern. 510 Linien dieser Population wurden in dieser Studie verwendet, obwohl aufgrund schlechter Keimung und anderer Qualitätskontrollprobleme nicht alle Linien für die Analyse aller drei Merkmale herangezogen wurden. Letztlich wurden Daten von 345 Linien für die Analyse der Chitinreaktion, 472 Linien für die flg22-Reaktion und 456 für die TLS-Resistenz verwendet.B. cookeiStamm LSLP18 wurde von Dr. Burt Bluhm an der University of Arkansas erhalten.
MAMP-Antwortmessung
In dieser Studie wurden zwei verschiedene MAMPs verwendet: flg22 (Genscript Katalognummer RP19986) und Chitin. Sorghumpflanzen wurden in Einsätzen auf mit Erde (33 % Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) gefüllten Schalen im Gewächshaus angebaut. Die Pflanzen wurden am Tag vor der Probenentnahme gegossen, um zusätzliche Blattfeuchtigkeit am Entnahmetag zu vermeiden.
Die Linien wurden randomisiert und aus logistischen Gründen in Gruppen von je 60 Linien ausgepflanzt. Für jede Linie wurden drei „Töpfe“ mit jeweils zwei Samen bepflanzt. Nachfolgende Gruppen wurden unmittelbar nach der Verarbeitung der vorherigen Gruppe ausgepflanzt, bis die gesamte Population untersucht war. Für beide MAMPs wurden zwei Versuchsdurchläufe durchgeführt, wobei die Genotypen jeweils neu randomisiert wurden.
ROS-Tests wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt. Kurz gesagt wurden für jede Linie sechs Samen in drei verschiedene Töpfe gepflanzt. Aus den resultierenden Setzlingen wurden drei aufgrund ihrer Einheitlichkeit ausgewählt. Setzlinge, die ungewöhnlich aussahen oder deutlich größer oder kleiner als die Mehrheit waren, wurden nicht verwendet. Vier Blattscheiben mit 3 mm Durchmesser wurden aus dem breitesten Teil des vierten Blattes von drei verschiedenen 15 Tage alten Sorghumpflanzen herausgeschnitten. Eine Scheibe pro Blatt von zwei Pflanzen und zwei Scheiben von einer Pflanze, wobei die zweite Scheibe als Wasserkontrolle diente (siehe unten). Die Scheiben wurden einzeln auf 50 µl H2O in einer schwarzen 96-Well-Platte schwimmen gelassen, mit einem Aluminiumsiegel verschlossen, um Lichteinwirkung zu vermeiden, und über Nacht bei Raumtemperatur aufbewahrt. Am nächsten Morgen wurde eine Reaktionslösung mit 2 mg/ml Chemilumineszenzsonde L-012 (Wako, Katalognr. 120-04891), 2 mg/ml Meerrettichperoxidase (Typ VI-A, Sigma-Aldrich, Katalognr. P6782) und 100 mg/ml Chitin oder 2 µM Flg22 hergestellt. 50 µl dieser Reaktionslösung wurden in drei der vier Vertiefungen gegeben. Die vierte Vertiefung diente als Scheinkontrolle, zu der die Reaktionslösung ohne MAMP hinzugefügt wurde. Jede Platte enthielt außerdem vier leere Vertiefungen mit reinem Wasser.
Nach Zugabe der Reaktionslösung wurde die Lumineszenz eine Stunde lang alle zwei Minuten mit einem SynergyTM 2 Multi-Detektions-Mikroplatten-Reader (BioTek) gemessen. Der Platten-Reader führt während dieser Stunde alle zwei Minuten Lumineszenzmessungen durch. Die Summe aller 31 Messwerte wurde berechnet, um den Wert für jede Vertiefung zu ermitteln. Der Schätzwert für die MAMP-Reaktion für jeden Genotyp wurde wie folgt berechnet: (durchschnittlicher Lumineszenzwert der drei experimentellen Vertiefungen – der Mock-Well-Wert) minus dem durchschnittlichen Leerwert der Vertiefung. Die Leerwert-Well-Werte lagen durchweg nahe Null.
Blattscheiben vonNicotiana benthamiana, eine hochreaktive Sorghum-Linie (SC0003) und eine niedrigreaktive Sorghum-Linie (PI 6069) wurden zur Qualitätskontrolle ebenfalls als Kontrollen in jede 96-Well-Platte aufgenommen.
B. cookeiInokulumvorbereitung und Impfung
B. cookeiDas Inokulum wurde wie zuvor beschrieben vorbereitet. Kurz gesagt, wurden Sorghumkörner drei Tage lang in Wasser eingeweicht, gespült, in 1-Liter-Erlenmeyerkolben gefüllt und eine Stunde lang bei 15 psi und 121 °C autoklaviert. Anschließend wurden die Körner mit etwa 5 ml mazeriertem Myzel aus einer frischen Kultur vonB. cookeiLSLP18-Isolate wurden zwei Wochen lang bei Raumtemperatur stehen gelassen, wobei die Kolben alle drei Tage geschüttelt wurden. Nach zwei Wochen wurden die pilzbefallenen Sorghumkörner luftgetrocknet und anschließend bis zur Feldinokulation bei 4 °C gelagert. Das gleiche Inokulum wurde für den gesamten Versuch verwendet und jährlich frisch hergestellt. Zur Inokulation wurden 6–10 befallene Körner in den Wirtel von 4–5 Wochen alten Sorghumpflanzen gegeben. Die von diesen Pilzen produzierten Sporen lösten innerhalb einer Woche eine Infektion der jungen Sorghumpflanzen aus.
Saatvorbereitung
Vor der Aussaat wurde das Sorghumsaatgut mit einer Mischung aus Fungizid, Insektizid und Safener behandelt. Diese Mischung enthielt ca. 1 % Spirato 480 FS Fungizid, 4 % Sebring 480 FS Fungizid und 3 % Sorpro 940 ES Saatgutsafener. Anschließend wurde das Saatgut drei Tage lang luftgetrocknet, wodurch eine dünne Schicht dieser Mischung die Samen umhüllte. Der Safener ermöglichte den Einsatz des Herbizids Dual Magnum als Vorauflaufbehandlung.
Bewertung der Resistenz gegen Blattflecken
Das SCP wurde am 14. und 15. Juni 2017 und am 20. Juni 2018 in einem randomisierten Blockdesign mit jeweils zwei Versuchsreplikationen an der Central Crops Research Station in Clayton (North Carolina) gepflanzt. Die Versuche wurden in 1,8 m langen Einzelreihen mit einer Reihenbreite von 0,9 m gepflanzt, wobei 10 Samen pro Parzelle verwendet wurden. Um Randeffekte zu vermeiden, wurden zwei Randreihen um die Peripherie jedes Versuchs gepflanzt. Die Versuche wurden am 20. Juli 2017 und 20. Juli 2018 beimpft, zu diesem Zeitpunkt befanden sich die Sorghumpflanzen im Wachstumsstadium 3. Die Bewertungen wurden auf einer Skala von eins bis neun vorgenommen, wobei Pflanzen ohne Krankheitsanzeichen mit neun und völlig abgestorbene Pflanzen mit eins bewertet wurden. Im Jahr 2017 wurden zwei Bewertungen und im Jahr 2018 vier Messungen vorgenommen, beginnend jedes Jahr zwei Wochen nach der Beimpfung. sAUDPC (standardisierte Fläche unter der Krankheitsprogressionskurve) wurde wie zuvor beschrieben berechnet.
Beitragszeit: 01.04.2021