Pflanzen- und Krankheitserregermaterialien
Eine Sorghum-Assoziationskartierungspopulation, bekannt als Sorghum Conversion Population (SCP), wurde von Dr. Pat Brown an der University of Illinois (heute UC Davis) bereitgestellt. Sie wurde bereits beschrieben und ist eine Sammlung verschiedener Linien, die auf Photoperiodenunempfindlichkeit und kleinere Wuchshöhe umgestellt wurden, um das Wachstum und die Entwicklung der Pflanzen in US-amerikanischen Klimazonen zu fördern. 510 Linien dieser Population wurden in dieser Studie verwendet. Aufgrund schlechter Keimung und anderer Probleme bei der Qualitätskontrolle konnten jedoch nicht alle Linien in die Analyse aller drei Merkmale einbezogen werden. Letztendlich wurden Daten von 345 Linien für die Analyse der Chitin-Reaktion, von 472 Linien für die flg22-Reaktion und von 456 Linien für die TLS-Resistenz verwendet.B. cookeiDer Stamm LSLP18 wurde von Dr. Burt Bluhm an der Universität von Arkansas bezogen.
MAMP-Reaktionsmessung
In dieser Studie wurden zwei verschiedene MAMPs verwendet: flg22 (Genscript-Katalognummer RP19986) und Chitin. Sorghumpflanzen wurden in Einsätzen auf mit Erde (33 % Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) gefüllten Anzuchtplatten im Gewächshaus kultiviert. Die Pflanzen wurden am Vortag der Probenentnahme bewässert, um überschüssige Blattfeuchtigkeit am Entnahmetag zu vermeiden.
Die Linien wurden randomisiert und aus logistischen Gründen in Gruppen von 60 Linien ausgesät. Pro Linie wurden drei Töpfe mit je zwei Samen bepflanzt. Die nachfolgenden Gruppen wurden jeweils nach der Verarbeitung der vorherigen Gruppe ausgesät, bis die gesamte Population untersucht war. Für beide MAMPs wurden zwei Versuchsreihen durchgeführt, wobei die Genotypen in jeder der beiden Reihen neu randomisiert wurden.
ROS-Tests wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt. Kurz gesagt, wurden für jede Linie sechs Samen in drei verschiedenen Töpfen ausgesät. Aus den daraus entstandenen Sämlingen wurden drei anhand ihrer Einheitlichkeit ausgewählt. Sämlinge mit ungewöhnlichem Aussehen oder deutlich größer oder kleiner als die Mehrheit wurden nicht verwendet. Vier Blattscheiben mit 3 mm Durchmesser wurden aus dem breitesten Teil des vierten Blattes von drei verschiedenen, 15 Tage alten Sorghumpflanzen ausgeschnitten. Jeweils eine Scheibe pro Blatt von zwei Pflanzen und zwei Scheiben von einer Pflanze, wobei die zweite Scheibe als Wasserkontrolle diente (siehe unten). Die Scheiben wurden einzeln in 50 µl H₂O in einer schwarzen 96-Well-Platte schwimmen gelassen, mit einer Aluminiumfolie lichtgeschützt verschlossen und über Nacht bei Raumtemperatur aufbewahrt. Am nächsten Morgen wurde eine Reaktionslösung mit 2 mg/ml Chemilumineszenzsonde L-012 (Wako, Katalognr. 120-04891), 2 mg/ml Meerrettichperoxidase (Typ VI-A, Sigma-Aldrich, Katalognr. P6782) und 100 mg/ml Chitin oder 2 µM Flg22 hergestellt. 50 µl dieser Reaktionslösung wurden in drei der vier Vertiefungen pipettiert. Die vierte Vertiefung diente als Negativkontrolle und enthielt die Reaktionslösung ohne MAMP. Zusätzlich wurden auf jeder Platte vier Blindproben mit Wasser als alleinige Lösung vorgelegt.
Nach Zugabe der Reaktionslösung wurde die Lumineszenz mit einem Synergy™ 2 Multi-Detektions-Mikrotiterplatten-Reader (BioTek) alle 2 Minuten über einen Zeitraum von 1 Stunde gemessen. Der Reader erfasste die Lumineszenz alle 2 Minuten während dieser Stunde. Die Summe aller 31 Messwerte wurde berechnet, um den Wert für jede Vertiefung zu erhalten. Der geschätzte Wert der MAMP-Antwort für jeden Genotyp wurde als Differenz zwischen dem mittleren Lumineszenzwert der drei experimentellen Vertiefungen und dem Wert der Kontrollvertiefung berechnet. Die Werte der Kontrollvertiefungen lagen durchgehend nahe null.
Blattscheiben vonNicotiana benthamianaZur Qualitätssicherung wurden in jeder 96-Well-Platte außerdem eine hochreaktive Sorghumlinie (SC0003) und eine niedrigreaktive Sorghumlinie (PI 6069) als Kontrollen mitgeführt.
B. cookeiInokulumpräparation und Inokulation
B. cookeiDas Inokulum wurde wie zuvor beschrieben hergestellt. Kurz gesagt, wurden Sorghumkörner drei Tage lang in Wasser eingeweicht, abgespült, in 1-Liter-Erlenmeyerkolben gefüllt und eine Stunde lang bei 15 psi und 121 °C autoklaviert. Anschließend wurden die Körner mit etwa 5 ml mazeriertem Myzel aus einer frischen Kultur beimpft.B. cookeiLSLP18-Isolate wurden zwei Wochen lang bei Raumtemperatur inkubiert, wobei die Kolben alle drei Tage geschüttelt wurden. Nach zwei Wochen wurden die mit Pilzen befallenen Sorghumkörner luftgetrocknet und bis zur Feldimpfung bei 4 °C gelagert. Für den gesamten Versuch wurde dasselbe Inokulum verwendet und jährlich frisch hergestellt. Zur Impfung wurden 6–10 befallene Körner in den Blattachsel von 4–5 Wochen alten Sorghumpflanzen gegeben. Die von diesen Pilzen produzierten Sporen induzierten innerhalb einer Woche eine Infektion in den jungen Sorghumpflanzen.
Saatgutvorbereitung
Vor der Aussaat wurde das Sorghumsaatgut mit einer Mischung aus Fungizid, Insektizid und Safener behandelt, die ca. 1 % Spirato 480 FS (Fungizid), 4 % Sebring 480 FS (Fungizid) und 3 % Sorpro 940 ES (Saatgut-Safener) enthielt. Anschließend wurden die Samen drei Tage lang luftgetrocknet, wodurch sich eine dünne Schicht der Mischung um die Samen bildete. Der Safener ermöglichte den Einsatz des Herbizids Dual Magnum als Vorauflaufbehandlung.
Bewertung der Zielblattfleckenresistenz
Die Sorghum-Pflanzen wurden am 14. und 15. Juni 2017 sowie am 20. Juni 2018 an der Central Crops Research Station in Clayton, North Carolina, in einem randomisierten Blockversuch mit jeweils zwei Wiederholungen angebaut. Die Aussaat erfolgte in 1,8 m langen Einzelreihen mit einem Reihenabstand von 0,9 m und einer Aussaatmenge von 10 Samen pro Parzelle. Um Randeffekte zu vermeiden, wurden zwei Randreihen angelegt. Die Inokulation der Pflanzen erfolgte am 20. Juli 2017 und am 20. Juli 2018, als sich die Sorghum-Pflanzen im Wachstumsstadium 3 befanden. Die Bewertung erfolgte auf einer Skala von eins bis neun, wobei Pflanzen ohne Krankheitsanzeichen mit neun und vollständig abgestorbene Pflanzen mit eins bewertet wurden. Im Jahr 2017 wurden zwei und im Jahr 2018 vier Bewertungen durchgeführt, jeweils zwei Wochen nach der Inokulation. Die standardisierte Fläche unter der Krankheitsverlaufskurve (sAUDPC) wurde wie zuvor beschrieben berechnet.
Veröffentlichungsdatum: 01.04.2021