Pflanzen- und Krankheitserregermaterialien
Eine Sorghum-Assoziationskartierungspopulation, bekannt als Sorghum Conversion Population (SCP), wurde von Dr. Pat Brown von der University of Illinois (jetzt an der UC Davis) bereitgestellt.Es wurde bereits zuvor beschrieben und ist eine Sammlung verschiedener Linien, die auf Photoperiodenunempfindlichkeit und kleinere Statur umgestellt wurden, um das Wachstum und die Entwicklung der Pflanzen in US-amerikanischen Umgebungen zu erleichtern.510 Linien dieser Population wurden in dieser Studie verwendet, obwohl aufgrund schlechter Keimung und anderer Qualitätskontrollprobleme nicht alle Linien bei der Analyse aller drei Merkmale verwendet wurden.Letztendlich wurden Daten von 345 Linien für die Analyse der Chitin-Reaktion, 472 Linien für die flg22-Reaktion und 456 für die TLS-Resistenz verwendet.B. CookeiStamm LSLP18 wurde von Dr. Burt Bluhm an der University of Arkansas erhalten.
Messung der MAMP-Reaktion
In dieser Studie wurden zwei verschiedene MAMPs verwendet: flg22 (Genscript-Katalog Nr. RP19986) und Chitin.Sorghumpflanzen wurden in Einsätzen gezüchtet, die auf mit Erde (33 % Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) gefüllten Flächen im Gewächshaus ausgelegt waren.Die Pflanzen wurden am Tag vor der Probenentnahme bewässert, um eine zusätzliche Blattfeuchtigkeit am Tag der Probenentnahme zu vermeiden.
Die Linien wurden randomisiert und aus logistischen Gründen in Gruppen von 60 Linien gepflanzt.Für jede Linie wurden drei „Töpfe“ mit zwei Samen pro Linie bepflanzt.Nachfolgende Chargen wurden gepflanzt, sobald die vorherige Charge verarbeitet worden war, bis die gesamte Population beurteilt war.Für beide MAMPs wurden zwei experimentelle Läufe durchgeführt, wobei die Genotypen in jedem der beiden Läufe neu randomisiert wurden.
ROS-Tests wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt.Kurz gesagt, für jede Linie wurden sechs Samen in drei verschiedene Töpfe gepflanzt.Aus den resultierenden Sämlingen wurden drei aufgrund ihrer Homogenität ausgewählt.Sämlinge, die ungewöhnlich aussahen oder deutlich größer oder kleiner waren als die Mehrheit, wurden nicht verwendet.Vier Blattscheiben mit einem Durchmesser von 3 mm wurden aus dem breitesten Teil des 4. Blattes von drei verschiedenen 15 Tage alten Sorghumpflanzen herausgeschnitten.Eine Scheibe pro Blatt von zwei Pflanzen und zwei Scheiben von einer Pflanze, wobei die zweite Scheibe zur Wasserregulierung dient (siehe unten).Die Scheiben wurden einzeln auf 50 µl H20 in einer schwarzen 96-Well-Platte geschwommen, mit einer Aluminiumdichtung versiegelt, um Lichteinwirkung zu vermeiden, und über Nacht bei Raumtemperatur aufbewahrt.Am nächsten Morgen wurde eine Reaktionslösung unter Verwendung von 2 mg/ml Chemilumineszenzsonde L-012 (Wako, Katalog-Nr. 120-04891), 2 mg/ml Meerrettichperoxidase (Typ VI-A, Sigma-Aldrich, Katalog-Nr. P6782) und … hergestellt 100 mg/ml Chitin oder 2 μM Flg22.50 µl dieser Reaktionslösung wurden in drei der vier Vertiefungen gegeben.Die vierte Vertiefung war eine Scheinkontrolle, zu der die Reaktionslösung ohne MAMP hinzugefügt wurde.In jeder Platte befanden sich außerdem vier leere Vertiefungen, die nur Wasser enthielten.
Nach Zugabe der Reaktionslösung wurde die Lumineszenz 1 Stunde lang alle 2 Minuten mit dem SynergyTM 2 Multidetektions-Mikroplattenlesegerät (BioTek) gemessen.Der Plattenleser führt während dieser 1 Stunde alle 2 Minuten Lumineszenzmessungen durch.Die Summe aller 31 Messwerte wurde berechnet, um den Wert für jede Vertiefung zu ergeben.Der geschätzte Wert für die MAMP-Reaktion für jeden Genotyp wurde berechnet als (durchschnittlicher Lumineszenzwert der drei Versuchsvertiefungen – der Scheinvertiefungswert) – minus dem durchschnittlichen Blindvertiefungswert.Die Leergutwerte lagen durchweg nahe bei Null.
Blattscheiben vonNicotiana benthamianaZu Zwecken der Qualitätskontrolle wurden in jeder 96-Well-Platte auch eine stark reagierende Sorghum-Linie (SC0003) und eine schwach reagierende Sorghum-Linie (PI 6069) als Kontrollen enthalten.
B. CookeiVorbereitung und Impfung des Inokulums
B. CookeiDas Inokulum wurde wie zuvor beschrieben hergestellt.Kurz gesagt, Sorghumkörner wurden drei Tage lang in Wasser eingeweicht, abgespült, in 1-Liter-Erlenmeyerkolben geschöpft und eine Stunde lang bei 15 psi und 121 °C autoklaviert.Die Körner wurden dann mit etwa 5 ml mazeriertem Myzel aus einer frischen Kultur beimpftB. CookeiLSLP18 wird isoliert und 2 Wochen bei Raumtemperatur belassen, wobei die Kolben alle 3 Tage geschüttelt werden.Nach zwei Wochen wurden die mit Pilzen befallenen Sorghumkörner an der Luft getrocknet und dann bis zur Feldbeimpfung bei 4 °C gelagert.Für den gesamten Versuch wurde das gleiche Inokulum verwendet und jedes Jahr frisch hergestellt.Zur Inokulation wurden 6–10 befallene Körner in den Wirtel von 4–5 Wochen alten Sorghumpflanzen gegeben.Die von diesen Pilzen produzierten Sporen lösten innerhalb einer Woche eine Infektion der jungen Sorghumpflanzen aus.
Saatgutvorbereitung
Vor der Aussaat auf dem Feld wurde Sorghumsamen mit einer Fungizid-, Insektizid- und Safener-Mischung behandelt, die ~ 1 % Spirato 480 FS-Fungizid, 4 % Sebring 480 FS-Fungizid und 3 % Sorpro 940 ES-Saatgutsafener enthielt.Anschließend wurden die Samen drei Tage lang an der Luft getrocknet, wodurch eine dünne Schicht dieser Mischung um die Samen herum entstand.Der Safener ermöglichte den Einsatz des Herbizids Dual Magnum als Vorauflaufbehandlung.
Bewertung der Target-Blattflecken-Resistenz
Das SCP wurde am 14.–15. Juni 2017 und am 20. Juni 2018 in der Central Crops Research Station in Clayton, NC, in einem randomisierten vollständigen Blockdesign mit jeweils zwei experimentellen Replikationen gepflanzt.Die Versuche wurden in 1,8 m langen Einzelreihen mit einer Reihenbreite von 0,9 m mit 10 Samen pro Parzelle gepflanzt.Um Randeffekte zu verhindern, wurden um den Rand jedes Experiments zwei Randreihen gepflanzt.Die Experimente wurden am 20. Juli 2017 und 20. Juli 2018 inokuliert. Zu diesem Zeitpunkt befanden sich die Sorghumpflanzen im Wachstumsstadium 3. Die Bewertungen erfolgten auf einer Skala von eins bis neun, wobei Pflanzen, die keine Anzeichen einer Krankheit zeigten, mit neun und vollständig bewertet wurden tote Pflanzen wurden als eins gewertet.Im Jahr 2017 wurden zwei Bewertungen und im Jahr 2018 vier Messungen vorgenommen, beginnend jedes Jahr zwei Wochen nach der Impfung.sAUDPC (standardisierte Fläche unter der Krankheitsprogressionskurve) wurde wie zuvor beschrieben berechnet.
Zeitpunkt der Veröffentlichung: 01.04.2021