Die Niederschlagsverteilung in der Provinz Guizhou ist ungleichmäßig, mit mehr Niederschlag im Frühjahr und Sommer, aber die Rapssetzlinge sind im Herbst und Winter anfällig für Trockenstress, was den Ertrag stark beeinträchtigt. Senf ist eine spezielle Ölsaat, die hauptsächlich in der Provinz Guizhou angebaut wird. Sie ist sehr trockenheitsresistent und kann in Bergregionen angebaut werden. Sie ist eine reiche Quelle trockenheitsresistenter Gene. Die Entdeckung trockenheitsresistenter Gene ist von entscheidender Bedeutung für die Verbesserung von Senfsorten und die Innovation von Keimplasmaressourcen. Die GRF-Familie spielt eine entscheidende Rolle für Pflanzenwachstum und -entwicklung sowie für die Reaktion auf Trockenstress. Bislang wurden GRF-Gene in Arabidopsis 2, Reis (Oryza sativa) 12, Raps 13, Baumwolle (Gossypium hirsutum) 14, Weizen (Triticum aestivum)15, Perlhirse (Setaria italica)16 und Brassica17 gefunden, aber es gibt keine Berichte über den Nachweis von GRF-Genen in Senf. In dieser Studie wurden die GRF-Gene der Senfsorte genomweit identifiziert und ihre physikalischen und chemischen Eigenschaften, evolutionären Beziehungen, Homologie, konservierten Motive, Genstruktur, Genduplikationen, cis-Elemente und das Keimlingsstadium (Vierblattstadium) analysiert. Die Expressionsmuster unter Trockenstress wurden umfassend analysiert, um eine wissenschaftliche Grundlage für weitere Studien zur potenziellen Funktion der BjGRF-Gene bei der Dürrereaktion zu schaffen und Kandidatengene für die Züchtung dürretoleranter Senfsorten zu finden.
Mithilfe zweier HMMER-Suchen wurden 34 BjGRF-Gene im Genom von Brassica juncea identifiziert, die alle die Domänen QLQ und WRC enthalten. Die CDS-Sequenzen der identifizierten BjGRF-Gene sind in der Ergänzungstabelle S1 dargestellt. BjGRF01–BjGRF34 sind nach ihrer Position auf dem Chromosom benannt. Die physikochemischen Eigenschaften dieser Familie deuten darauf hin, dass die Aminosäurelänge sehr variabel ist und von 261 aa (BjGRF19) bis 905 aa (BjGRF28) reicht. Der isoelektrische Punkt von BjGRF reicht von 6,19 (BjGRF02) bis 9,35 (BjGRF03) mit einem Durchschnitt von 8,33, und 88,24 % von BjGRF ist ein basisches Protein. Der vorhergesagte Molekulargewichtsbereich von BjGRF liegt zwischen 29,82 kDa (BjGRF19) und 102,90 kDa (BjGRF28); der Instabilitätsindex der BjGRF-Proteine liegt zwischen 51,13 (BjGRF08) und 78,24 (BjGRF19), alle sind größer als 40, was darauf hindeutet, dass der Fettsäureindex zwischen 43,65 (BjGRF01) und 78,78 (BjGRF22) liegt; die durchschnittliche Hydrophilie (GRAVY) liegt zwischen -1,07 (BjGRF31) und -0,45 (BjGRF22); alle hydrophilen BjGRF-Proteine haben negative GRAVY-Werte, was auf die durch die Rückstände verursachte fehlende Hydrophobie zurückzuführen sein kann. Die Vorhersage der subzellulären Lokalisierung zeigte, dass 31 BjGRF-kodierte Proteine im Zellkern lokalisiert werden konnten, BjGRF04 in Peroxisomen, BjGRF25 im Zytoplasma und BjGRF28 in Chloroplasten (Tabelle 1), was darauf hindeutet, dass BjGRFs im Zellkern lokalisiert sein könnten und als Transkriptionsfaktor eine wichtige regulatorische Rolle spielen.
Die phylogenetische Analyse von GRF-Familien in verschiedenen Arten kann bei der Untersuchung von Genfunktionen helfen. Daher wurden die vollständigen Aminosäuresequenzen von 35 Raps-, 16 Rüben-, 12 Reis-, 10 Hirse- und 9 Arabidopsis-GRFs heruntergeladen und ein phylogenetischer Baum anhand von 34 identifizierten BjGRF-Genen erstellt (Abb. 1). Die drei Unterfamilien enthalten eine unterschiedliche Anzahl von Mitgliedern; 116 GRF-TFs sind in drei verschiedene Unterfamilien (Gruppen A–C) unterteilt, die jeweils 59 (50,86 %), 34 (29,31 %) und 23 (19,83) % der GRFs enthalten. Darunter sind 34 Mitglieder der BjGRF-Familie über 3 Unterfamilien verstreut: 13 Mitglieder in Gruppe A (38,24 %), 12 Mitglieder in Gruppe B (35,29 %) und 9 Mitglieder in Gruppe C (26,47 %). Im Zuge der Senfpolyploidisierung variiert die Anzahl der BjGRF-Gene in verschiedenen Unterfamilien, sodass es zu Genamplifikation und -verlust kommen kann. Bemerkenswert ist, dass Reis- und Hirse-GRFs in Gruppe C nicht verteilt sind, während Gruppe B zwei Reis-GRFs und ein Hirse-GRF enthält. Die meisten Reis- und Hirse-GRFs sind in einem Zweig zusammengefasst, was auf eine enge Verwandtschaft der BjGRFs mit Dikotyledonen hindeutet. Die umfassendsten Studien zur GRF-Funktion in Arabidopsis thaliana bilden die Grundlage für Funktionsstudien der BjGRFs.
Phylogenetischer Baum des Senfs, einschließlich Brassica napus, Brassica napus, Reis, Hirse und Mitglieder der Arabidopsis thaliana GRF-Familie.
Analyse repetitiver Gene in der Senf-GRF-Familie. Die graue Linie im Hintergrund stellt einen synchronisierten Block im Senfgenom dar, die rote Linie stellt ein Paar segmentierter Wiederholungen des BjGRF-Gens dar;
BjGRF-Genexpression unter Trockenstress im vierten Blattstadium. qRT-PCR-Daten sind in der Ergänzungstabelle S5 dargestellt. Signifikante Unterschiede in den Daten sind durch Kleinbuchstaben gekennzeichnet.
Angesichts des fortschreitenden globalen Klimawandels ist die Untersuchung der Bewältigung von Nutzpflanzen mit Trockenstress und die Verbesserung ihrer Toleranzmechanismen zu einem wichtigen Forschungsthema geworden18. Nach einer Dürre verändern sich morphologische Struktur, Genexpression und Stoffwechselprozesse von Pflanzen, was zum Stillstand der Photosynthese und zu Stoffwechselstörungen führen kann, was sich wiederum auf Ertrag und Qualität der Nutzpflanzen auswirkt19,20,21. Wenn Pflanzen Trockenheitssignale wahrnehmen, produzieren sie sekundäre Botenstoffe wie Ca2+ und Phosphatidylinositol, erhöhen die intrazelluläre Calciumionenkonzentration und aktivieren das regulatorische Netzwerk des Proteinphosphorylierungswegs22,23. Das endgültige Zielprotein ist direkt an der Zellabwehr beteiligt oder reguliert über TFs die Expression verwandter Stressgene und erhöht so die Stresstoleranz der Pflanze24,25. TFs spielen also eine entscheidende Rolle bei der Reaktion auf Trockenstress. Anhand der Sequenz und der DNA-Bindungseigenschaften der auf Trockenstress reagierenden TFs können diese in verschiedene Familien unterteilt werden, beispielsweise GRF, ERF, MYB, WRKY und andere Familien26.
Die GRF-Genfamilie ist ein Typ pflanzenspezifischer TF, der in verschiedenen Bereichen wie Wachstum, Entwicklung, Signaltransduktion und Abwehrreaktionen der Pflanze eine wichtige Rolle spielt27. Seit das erste GRF-Gen in O. sativa identifiziert wurde28, wurden immer mehr GRF-Gene in vielen Arten identifiziert und es wurde gezeigt, dass sie Wachstum, Entwicklung und Stressreaktion der Pflanzen beeinflussen8, 29, 30,31,32. Mit der Veröffentlichung der Genomsequenz von Brassica juncea wurde die Identifizierung der BjGRF-Genfamilie möglich33. In dieser Studie wurden 34 BjGRF-Gene im gesamten Senfgenom identifiziert und aufgrund ihrer chromosomalen Position BjGRF01–BjGRF34 genannt. Sie alle enthalten hochkonservierte QLQ- und WRC-Domänen. Die Analyse der physikochemischen Eigenschaften zeigte, dass die Unterschiede in den Aminosäurezahlen und Molekulargewichten der BjGRF-Proteine (außer BjGRF28) nicht signifikant waren Die Genstrukturanalyse ergab, dass 64,7 % der BjGRF-Gene 4 Exons enthielten. Dies weist darauf hin, dass die BjGRF-Genstruktur in der Evolution relativ konserviert geblieben ist, die Gene BjGRF10, BjGRF16, BjGRP28 und BjGRF29 jedoch eine größere Anzahl an Exons aufweisen. Studien haben gezeigt, dass das Hinzufügen oder Löschen von Exons oder Introns zu Unterschieden in der Genstruktur und -funktion führen und dadurch neue Gene entstehen können34,35,36. Daher vermuten wir, dass das Intron von BjGRF im Laufe der Evolution verloren gegangen ist, was zu Veränderungen der Genfunktion führen könnte. In Übereinstimmung mit bestehenden Studien haben wir auch herausgefunden, dass die Anzahl der Introns mit der Genexpression zusammenhängt. Wenn ein Gen viele Introns aufweist, kann es schnell auf verschiedene ungünstige Faktoren reagieren.
Genduplikation ist ein wichtiger Faktor in der genomischen und genetischen Evolution37. Verwandte Studien haben gezeigt, dass Genduplikation nicht nur die Zahl der GRF-Gene erhöht, sondern auch als Mittel zur Erzeugung neuer Gene dient, die Pflanzen bei der Anpassung an verschiedene widrige Umweltbedingungen unterstützen38. In dieser Studie wurden insgesamt 48 doppelte Genpaare gefunden, bei denen es sich allesamt um segmentale Duplikationen handelte, was darauf hindeutet, dass segmentale Duplikationen der wichtigste Mechanismus zur Erhöhung der Genzahl in dieser Familie sind. In der Literatur wurde berichtet, dass segmentale Duplikation die Amplifikation von Mitgliedern der GRF-Genfamilie in Arabidopsis und Erdbeere wirksam fördern kann, und bei keiner der Arten wurde eine Tandemduplikation dieser Genfamilie festgestellt27,39. Die Ergebnisse dieser Studie stehen im Einklang mit bestehenden Studien zu Arabidopsis thaliana und Erdbeerfamilien und legen nahe, dass die GRF-Familie durch segmentale Duplikation in verschiedenen Pflanzen die Zahl der Gene erhöhen und neue Gene erzeugen kann.
In dieser Studie wurden insgesamt 34 BjGRF-Gene in Senf identifiziert, die in 3 Unterfamilien unterteilt wurden. Diese Gene zeigten ähnliche konservierte Motive und Genstrukturen. Die Kollinearitätsanalyse ergab 48 Paare von Segmentduplikationen in Senf. Die BjGRF-Promoterregion enthält cis-wirkende Elemente, die mit Lichtreaktion, hormoneller Reaktion, Reaktion auf Umweltstress sowie Wachstum und Entwicklung verbunden sind. Die Expression von 34 BjGRF-Genen wurde im Senfkeimlingsstadium (Wurzeln, Stängel, Blätter) und das Expressionsmuster von 10 BjGRF-Genen unter Dürrebedingungen festgestellt. Es wurde festgestellt, dass die Expressionsmuster von BjGRF-Genen unter Dürrestress ähnlich waren und möglicherweise ähnlich sind. Beteiligung an der Dürreregulation. BjGRF03- und BjGRF32-Gene können bei Dürrestress eine positive regulatorische Rolle spielen, während BjGRF06 und BjGRF23 bei Dürrestress als miR396-Zielgene eine Rolle spielen. Insgesamt liefert unsere Studie eine biologische Grundlage für die zukünftige Entdeckung der BjGRF-Genfunktion in Brassicaceae-Pflanzen.
Die für dieses Experiment verwendeten Senfkörner wurden vom Guizhou Oil Seed Research Institute der Guizhou Academy of Agricultural Sciences bereitgestellt. Wählen Sie die ganzen Samen aus und pflanzen Sie sie in Erde (Substrat: Erde = 3:1). Sammeln Sie Wurzeln, Stängel und Blätter nach dem Vierblattstadium. Die Pflanzen wurden mit 20 % PEG 6000 behandelt, um Trockenheit zu simulieren. Die Blätter wurden nach 0, 3, 6, 12 und 24 Stunden gesammelt. Alle Pflanzenproben wurden sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und anschließend für den nächsten Test in einem -80 °C-Gefrierschrank gelagert.
Alle im Rahmen dieser Studie gewonnenen oder analysierten Daten sind im veröffentlichten Artikel und in den ergänzenden Informationsdateien enthalten.
Veröffentlichungszeit: 22. Januar 2025