Die Niederschlagsverteilung in der Provinz Guizhou ist ungleichmäßig, mit höheren Niederschlägen im Frühling und Sommer. Rapssetzlinge sind jedoch im Herbst und Winter anfällig für Trockenstress, was den Ertrag erheblich beeinträchtigt. Senf ist eine spezielle Ölpflanze, die hauptsächlich in der Provinz Guizhou angebaut wird. Er ist sehr trockenheitstolerant und kann auch in Bergregionen kultiviert werden. Senf ist eine reichhaltige Quelle trockenheitsresistenter Gene. Die Entdeckung dieser Gene ist von entscheidender Bedeutung für die Verbesserung von Senfsorten und die Innovation im Bereich der Genressourcen. Die GRF-Familie spielt eine wichtige Rolle für Wachstum und Entwicklung von Pflanzen sowie für die Reaktion auf Trockenstress. Bislang wurden GRF-Gene in Arabidopsis 2, Reis (Oryza sativa) 12, Raps 13, Baumwolle (Gossypium hirsutum) 14, Weizen (Triticum aestivum) 15, Perlhirse (Setaria italica) 16 und Brassica 17 nachgewiesen. Bisher liegen jedoch keine Berichte über GRF-Gene in Senf vor. In dieser Studie wurden die GRF-Genfamilien von Senf genomweit identifiziert und ihre physikalischen und chemischen Eigenschaften, evolutionären Verwandtschaftsverhältnisse, Homologie, konservierten Motive, Genstruktur, Genduplikationen, cis-Elemente und das Keimlingsstadium (Vierblattstadium) analysiert. Die Expressionsmuster unter Trockenstress wurden umfassend analysiert, um eine wissenschaftliche Grundlage für weitere Untersuchungen zur potenziellen Funktion der BjGRF-Gene in der Trockenstressantwort zu schaffen und Kandidatengene für die Züchtung trockenheitstoleranter Senfsorten zu identifizieren.
Im Genom von Brassica juncea wurden mithilfe zweier HMMER-Suchen 34 BjGRF-Gene identifiziert, die alle die QLQ- und WRC-Domänen enthalten. Die CDS-Sequenzen der identifizierten BjGRF-Gene sind in der ergänzenden Tabelle S1 aufgeführt. BjGRF01–BjGRF34 sind nach ihrer Position auf dem Chromosom benannt. Die physikochemischen Eigenschaften dieser Familie zeigen eine hohe Variabilität der Aminosäuresequenzlänge, die von 261 Aminosäuren (BjGRF19) bis 905 Aminosäuren (BjGRF28) reicht. Der isoelektrische Punkt von BjGRF liegt zwischen 6,19 (BjGRF02) und 9,35 (BjGRF03) mit einem Durchschnitt von 8,33, und 88,24 % der BjGRF-Proteine sind basisch. Der vorhergesagte Molekulargewichtsbereich von BjGRF liegt zwischen 29,82 kDa (BjGRF19) und 102,90 kDa (BjGRF28); der Instabilitätsindex der BjGRF-Proteine liegt zwischen 51,13 (BjGRF08) und 78,24 (BjGRF19), wobei alle Werte über 40 liegen. Dies deutet darauf hin, dass der Fettsäureindex zwischen 43,65 (BjGRF01) und 78,78 (BjGRF22) liegt und die durchschnittliche Hydrophilie (GRAVY) zwischen -1,07 (BjGRF31) und -0,45 (BjGRF22) variiert. Alle hydrophilen BjGRF-Proteine weisen negative GRAVY-Werte auf, was auf einen Mangel an Hydrophobie aufgrund bestimmter Aminosäurereste zurückzuführen sein könnte. Die Vorhersage der subzellulären Lokalisation ergab, dass 31 BjGRF-kodierte Proteine im Zellkern lokalisiert sein könnten, BjGRF04 in Peroxisomen, BjGRF25 im Zytoplasma und BjGRF28 in Chloroplasten (Tabelle 1). Dies deutet darauf hin, dass BjGRFs im Zellkern lokalisiert sein könnten und als Transkriptionsfaktoren eine wichtige regulatorische Rolle spielen.
Die phylogenetische Analyse von GRF-Familien in verschiedenen Arten kann zur Untersuchung von Genfunktionen beitragen. Daher wurden die vollständigen Aminosäuresequenzen von 35 Raps-, 16 Rüben-, 12 Reis-, 10 Hirse- und 9 Arabidopsis-GRFs heruntergeladen und ein phylogenetischer Baum basierend auf 34 identifizierten BjGRF-Genen erstellt (Abb. 1). Die drei Unterfamilien umfassen unterschiedlich viele Mitglieder; 116 GRF-Transkriptionsfaktoren sind in drei verschiedene Unterfamilien (Gruppen A–C) unterteilt, die 59 (50,86 %), 34 (29,31 %) bzw. 23 (19,83 %) der GRFs enthalten. Darunter befinden sich 34 Mitglieder der BjGRF-Familie, die auf die drei Unterfamilien verteilt sind: 13 Mitglieder in Gruppe A (38,24 %), 12 Mitglieder in Gruppe B (35,29 %) und 9 Mitglieder in Gruppe C (26,47 %). Im Zuge der Polyploidisierung von Senf variiert die Anzahl der BjGRF-Gene in den verschiedenen Unterfamilien, und es kann zu Genamplifikation und -verlust gekommen sein. Bemerkenswert ist, dass in Gruppe C keine GRFs von Reis und Hirse vorkommen, während in Gruppe B zwei Reis-GRFs und ein Hirse-GRF vorhanden sind. Die meisten Reis- und Hirse-GRFs bilden einen gemeinsamen Zweig, was auf eine enge Verwandtschaft der BjGRFs mit Dikotylen hindeutet. Die umfassendsten Studien zur GRF-Funktion in Arabidopsis thaliana bilden die Grundlage für funktionelle Untersuchungen der BjGRFs.
Phylogenetischer Baum des Senfs einschließlich Brassica napus, Brassica napus, Reis, Hirse und Mitglieder der Arabidopsis thaliana GRF-Familie.
Analyse repetitiver Gene in der GRF-Familie des Senfs. Die graue Linie im Hintergrund stellt einen synchronisierten Block im Senfgenom dar, die rote Linie stellt ein Paar segmentierter Wiederholungen des BjGRF-Gens dar;
Die BjGRF-Genexpression unter Trockenstress im vierten Blattstadium wurde untersucht. Die qRT-PCR-Daten sind in der ergänzenden Tabelle S5 dargestellt. Signifikante Unterschiede sind durch Kleinbuchstaben gekennzeichnet.
Angesichts des fortschreitenden globalen Klimawandels hat die Erforschung der Bewältigungsstrategien von Nutzpflanzen unter Trockenstress und die Verbesserung ihrer Toleranzmechanismen zunehmend an Bedeutung gewonnen18. Nach einer Trockenperiode verändern sich die morphologische Struktur, die Genexpression und die Stoffwechselprozesse von Pflanzen, was zum Ausbleiben der Photosynthese und zu Stoffwechselstörungen führen und somit Ertrag und Qualität der Ernte beeinträchtigen kann19,20,21. Bei der Wahrnehmung von Trockenstresssignalen produzieren Pflanzen sekundäre Botenstoffe wie Ca2+ und Phosphatidylinositol, erhöhen die intrazelluläre Calciumionenkonzentration und aktivieren das regulatorische Netzwerk des Proteinphosphorylierungswegs22,23. Das Zielprotein ist direkt an der zellulären Abwehr beteiligt oder reguliert über Transkriptionsfaktoren (TFs) die Expression verwandter Stressgene und erhöht so die Stresstoleranz der Pflanze24,25. TFs spielen daher eine entscheidende Rolle bei der Reaktion auf Trockenstress. Entsprechend ihrer Sequenz und DNA-Bindungseigenschaften lassen sich trockenstressreaktive TFs in verschiedene Familien wie GRF, ERF, MYB, WRKY und andere einteilen26.
Die GRF-Genfamilie ist eine Gruppe pflanzenspezifischer Transkriptionsfaktoren, die wichtige Funktionen in verschiedenen Bereichen wie Wachstum, Entwicklung, Signaltransduktion und pflanzlichen Abwehrreaktionen erfüllen27. Seit der Identifizierung des ersten GRF-Gens in Oryza sativa28 wurden in zahlreichen Arten immer mehr GRF-Gene identifiziert, die nachweislich Pflanzenwachstum, -entwicklung und Stressreaktionen beeinflussen8,29,30,31,32. Mit der Veröffentlichung der Genomsequenz von Brassica juncea wurde die Identifizierung der BjGRF-Genfamilie möglich33. In dieser Studie wurden 34 BjGRF-Gene im gesamten Senfgenom identifiziert und anhand ihrer chromosomalen Position als BjGRF01–BjGRF34 bezeichnet. Alle diese Gene enthalten hochkonservierte QLQ- und WRC-Domänen. Die Analyse der physikochemischen Eigenschaften zeigte, dass die Unterschiede in der Anzahl der Aminosäuren und den Molekulargewichten der BjGRF-Proteine (mit Ausnahme von BjGRF28) nicht signifikant sind, was darauf hindeutet, dass die Mitglieder der BjGRF-Familie ähnliche Funktionen besitzen könnten. Die Analyse der Genstruktur zeigte, dass 64,7 % der BjGRF-Gene vier Exons enthalten. Dies deutet darauf hin, dass die BjGRF-Genstruktur im Laufe der Evolution relativ konserviert ist. Die Anzahl der Exons in den Genen BjGRF10, BjGRF16, BjGRF28 und BjGRF29 ist jedoch höher. Studien haben gezeigt, dass die Hinzufügung oder Entfernung von Exons oder Introns zu Unterschieden in Genstruktur und -funktion führen und dadurch neue Gene entstehen können34,35,36. Daher vermuten wir, dass das Intron von BjGRF im Laufe der Evolution verloren ging, was zu Veränderungen der Genfunktion führen könnte. Übereinstimmend mit bestehenden Studien fanden wir außerdem einen Zusammenhang zwischen der Anzahl der Introns und der Genexpression. Bei einer hohen Anzahl von Introns kann das Gen schneller auf verschiedene ungünstige Faktoren reagieren.
Genduplikation ist ein wichtiger Faktor der genomischen und genetischen Evolution37. Verwandte Studien haben gezeigt, dass Genduplikation nicht nur die Anzahl der GRF-Gene erhöht, sondern auch der Generierung neuer Gene dient, um Pflanzen bei der Anpassung an verschiedene widrige Umweltbedingungen zu unterstützen38. In dieser Studie wurden insgesamt 48 duplizierte Genpaare gefunden, die alle segmentale Duplikationen darstellten. Dies deutet darauf hin, dass segmentale Duplikationen der Hauptmechanismus für die Erhöhung der Genanzahl in dieser Familie sind. In der Literatur wurde berichtet, dass segmentale Duplikation die Amplifikation von GRF-Genfamilienmitgliedern in Arabidopsis und Erdbeeren effektiv fördern kann und dass in keiner der Arten eine Tandemduplikation dieser Genfamilie gefunden wurde27,39. Die Ergebnisse dieser Studie stimmen mit bestehenden Studien an Arabidopsis thaliana und Erdbeeren überein und legen nahe, dass die GRF-Familie durch segmentale Duplikation in verschiedenen Pflanzen die Genanzahl erhöhen und neue Gene generieren kann.
In dieser Studie wurden insgesamt 34 BjGRF-Gene in Senf identifiziert und in drei Unterfamilien unterteilt. Diese Gene wiesen ähnliche konservierte Motive und Genstrukturen auf. Eine Kollinearitätsanalyse ergab 48 Segmentduplikationen in Senf. Die BjGRF-Promotorregion enthält cis-regulatorische Elemente, die mit Licht-, Hormon- und Umweltstressreaktionen sowie Wachstum und Entwicklung assoziiert sind. Die Expression der 34 BjGRF-Gene wurde im Senfkeimlingsstadium (Wurzeln, Stängel, Blätter) untersucht, und das Expressionsmuster von 10 BjGRF-Genen wurde unter Trockenstressbedingungen analysiert. Es zeigte sich, dass die Expressionsmuster der BjGRF-Gene unter Trockenstress ähnlich sind und möglicherweise an der Trockenstressregulation beteiligt sind. Die Gene BjGRF03 und BjGRF32 könnten positive regulatorische Funktionen unter Trockenstress ausüben, während BjGRF06 und BjGRF23 als miR396-Zielgene eine Rolle bei Trockenstress spielen. Insgesamt liefert unsere Studie eine biologische Grundlage für die zukünftige Erforschung der Funktion des BjGRF-Gens in Brassicaceae-Pflanzen.
Die in diesem Experiment verwendeten Senfsamen wurden vom Guizhou Oil Seed Research Institute der Guizhou Academy of Agricultural Sciences bereitgestellt. Die ganzen Samen wurden ausgewählt und in Erde (Substrat:Erde = 3:1) ausgesät. Nach dem Vierblattstadium wurden Wurzeln, Stängel und Blätter geerntet. Die Pflanzen wurden mit 20 % PEG 6000 behandelt, um Trockenheit zu simulieren. Die Blätter wurden nach 0, 3, 6, 12 und 24 Stunden geerntet. Alle Pflanzenproben wurden sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und anschließend bei -80 °C für weitere Tests gelagert.
Alle im Rahmen dieser Studie erhobenen oder analysierten Daten sind im veröffentlichten Artikel und den ergänzenden Informationsdateien enthalten.
Veröffentlichungsdatum: 22. Januar 2025