Die Niederschlagsverteilung in der Provinz Guizhou ist ungleichmäßig, mit mehr Niederschlägen im Frühjahr und Sommer, aber die Rapssetzlinge sind im Herbst und Winter anfällig für Trockenstress, was den Ertrag stark beeinträchtigt. Senf ist eine besondere Ölsaat, die hauptsächlich in der Provinz Guizhou angebaut wird. Sie ist sehr trockenheitsresistent und kann in Bergregionen angebaut werden. Sie ist eine reiche Quelle trockenheitsresistenter Gene. Die Entdeckung trockenheitsresistenter Gene ist von entscheidender Bedeutung für die Verbesserung von Senfsorten und die Innovation bei den Keimplasmaressourcen. Die GRF-Familie spielt eine entscheidende Rolle für Pflanzenwachstum und -entwicklung sowie für die Reaktion auf Trockenstress. Bislang wurden GRF-Gene in Arabidopsis 2, Reis (Oryza sativa) 12, Raps 13, Baumwolle (Gossypium hirsutum) 14, Weizen (Triticum aestivum)15, Perlhirse (Setaria italica)16 und Brassica17 gefunden, aber es gibt keine Berichte über den Nachweis von GRF-Genen in Senf. In dieser Studie wurden die GRF-Gene des Senfs genomweit identifiziert und ihre physikalischen und chemischen Eigenschaften, evolutionären Beziehungen, Homologie, konservierten Motive, Genstruktur, Genduplikationen, cis-Elemente und das Keimlingsstadium (Vierblattstadium) analysiert. Die Expressionsmuster unter Trockenstress wurden umfassend analysiert, um eine wissenschaftliche Grundlage für weitere Studien zur potenziellen Funktion der BjGRF-Gene bei der Dürrereaktion zu schaffen und Kandidatengene für die Züchtung dürretoleranten Senfs bereitzustellen.
Mithilfe zweier HMMER-Suchen wurden 34 BjGRF-Gene im Genom von Brassica juncea identifiziert, die alle die Domänen QLQ und WRC enthalten. Die CDS-Sequenzen der identifizierten BjGRF-Gene sind in der Ergänzungstabelle S1 dargestellt. BjGRF01–BjGRF34 sind nach ihrer Position auf dem Chromosom benannt. Die physikochemischen Eigenschaften dieser Familie deuten darauf hin, dass die Aminosäurelänge sehr variabel ist und von 261 Aminosäuren (BjGRF19) bis 905 Aminosäuren (BjGRF28) reicht. Der isoelektrische Punkt von BjGRF reicht von 6,19 (BjGRF02) bis 9,35 (BjGRF03) mit einem Durchschnitt von 8,33, und 88,24 % von BjGRF sind basische Proteine. Der vorhergesagte Molekulargewichtsbereich von BjGRF liegt zwischen 29,82 kDa (BjGRF19) und 102,90 kDa (BjGRF28); der Instabilitätsindex von BjGRF-Proteinen liegt zwischen 51,13 (BjGRF08) und 78,24 (BjGRF19), alle sind größer als 40, was darauf hindeutet, dass der Fettsäureindex zwischen 43,65 (BjGRF01) und 78,78 (BjGRF22) liegt; die durchschnittliche Hydrophilie (GRAVY) liegt zwischen -1,07 (BjGRF31) und -0,45 (BjGRF22); alle hydrophilen BjGRF-Proteine haben negative GRAVY-Werte, was auf die durch die Rückstände verursachte fehlende Hydrophobie zurückzuführen sein kann. Die Vorhersage der subzellulären Lokalisierung zeigte, dass 31 BjGRF-kodierte Proteine im Zellkern lokalisiert werden konnten, BjGRF04 in Peroxisomen, BjGRF25 im Zytoplasma und BjGRF28 in Chloroplasten (Tabelle 1), was darauf hindeutet, dass BjGRFs im Zellkern lokalisiert sein könnten und als Transkriptionsfaktor eine wichtige regulatorische Rolle spielen.
Die phylogenetische Analyse von GRF-Familien in verschiedenen Arten kann bei der Untersuchung von Genfunktionen helfen. Daher wurden die vollständigen Aminosäuresequenzen von 35 Raps-, 16 Rüben-, 12 Reis-, 10 Hirse- und 9 Arabidopsis-GRFs heruntergeladen und ein phylogenetischer Baum anhand von 34 identifizierten BjGRF-Genen erstellt (Abb. 1). Die drei Unterfamilien enthalten eine unterschiedlich große Anzahl von Mitgliedern. 116 GRF-TFs sind in drei unterschiedliche Unterfamilien (Gruppen A–C) unterteilt, die jeweils 59 (50,86 %), 34 (29,31 %) und 23 (19,83) % der GRFs enthalten. Darunter sind 34 Mitglieder der BjGRF-Familie über 3 Unterfamilien verstreut: 13 Mitglieder in Gruppe A (38,24 %), 12 Mitglieder in Gruppe B (35,29 %) und 9 Mitglieder in Gruppe C (26,47 %). Im Verlauf der Senfpolyploidisierung variiert die Anzahl der BjGRF-Gene in verschiedenen Unterfamilien, sodass es zu Genamplifikation und -verlust kommen kann. Bemerkenswert ist, dass Reis- und Hirse-GRFs in Gruppe C nicht verteilt sind, während Gruppe B zwei Reis-GRFs und einen Hirse-GRF aufweist. Die meisten Reis- und Hirse-GRFs sind in einem Zweig zusammengefasst, was auf eine enge Verwandtschaft der BjGRFs mit Dikotyledonen hindeutet. Die umfassendsten Studien zur GRF-Funktion in Arabidopsis thaliana bilden die Grundlage für Funktionsstudien zu BjGRFs.
Phylogenetischer Baum des Senfs, einschließlich Brassica napus, Brassica napus, Reis, Hirse und Mitglieder der Arabidopsis thaliana GRF-Familie.
Analyse repetitiver Gene in der Senf-GRF-Familie. Die graue Linie im Hintergrund stellt einen synchronisierten Block im Senfgenom dar, die rote Linie stellt ein Paar segmentierter Wiederholungen des BjGRF-Gens dar;
BjGRF-Genexpression unter Trockenstress im vierten Blattstadium. qRT-PCR-Daten sind in der Ergänzungstabelle S5 dargestellt. Signifikante Datenunterschiede sind durch Kleinbuchstaben gekennzeichnet.
Angesichts des sich ständig verändernden globalen Klimas ist die Erforschung der Bewältigung von Trockenstress durch Nutzpflanzen und die Verbesserung ihrer Toleranzmechanismen zu einem wichtigen Forschungsthema geworden18. Nach einer Dürre verändern sich die morphologische Struktur, die Genexpression und die Stoffwechselprozesse von Pflanzen, was zum Stillstand der Photosynthese und zu Stoffwechselstörungen führen kann, was sich auf Ertrag und Qualität der Nutzpflanzen auswirkt19,20,21. Wenn Pflanzen Trockenheitssignale wahrnehmen, produzieren sie Botenstoffe wie Ca2+ und Phosphatidylinositol, erhöhen die intrazelluläre Calciumionenkonzentration und aktivieren das regulatorische Netzwerk des Proteinphosphorylierungswegs22,23. Das finale Zielprotein ist direkt an der zellulären Abwehr beteiligt oder reguliert über TFs die Expression verwandter Stressgene und erhöht so die Stresstoleranz der Pflanze24,25. Daher spielen TFs eine entscheidende Rolle bei der Reaktion auf Trockenstress. Anhand ihrer Sequenz und DNA-Bindungseigenschaften lassen sich trockensempfindliche TFs in verschiedene Familien wie GRF, ERF, MYB, WRKY und weitere Familien unterteilen26.
Die GRF-Genfamilie ist eine Art pflanzenspezifischer TF, der in verschiedenen Bereichen wie Wachstum, Entwicklung, Signaltransduktion und Abwehrreaktionen der Pflanze eine wichtige Rolle spielt27. Seit das erste GRF-Gen in O. sativa identifiziert wurde28, wurden immer mehr GRF-Gene in vielen Arten identifiziert und nachweislich das Wachstum, die Entwicklung und die Stressreaktion von Pflanzen beeinflussen8, 29, 30,31,32. Mit der Veröffentlichung der Genomsequenz von Brassica juncea wurde die Identifizierung der BjGRF-Genfamilie möglich33. In dieser Studie wurden 34 BjGRF-Gene im gesamten Senfgenom identifiziert und aufgrund ihrer chromosomalen Position BjGRF01–BjGRF34 genannt. Alle enthalten hochkonservierte QLQ- und WRC-Domänen. Die Analyse der physikochemischen Eigenschaften zeigte, dass die Unterschiede in den Aminosäurezahlen und Molekulargewichten der BjGRF-Proteine (mit Ausnahme von BjGRF28) nicht signifikant waren Die Genstrukturanalyse zeigte, dass 64,7 % der BjGRF-Gene 4 Exons enthielten, was darauf hindeutet, dass die BjGRF-Genstruktur in der Evolution relativ konserviert geblieben ist, aber die Anzahl der Exons in den Genen BjGRF10, BjGRF16, BjGRP28 und BjGRF29 größer ist. Studien haben gezeigt, dass das Hinzufügen oder Löschen von Exons oder Introns zu Unterschieden in der Genstruktur und -funktion führen und dadurch neue Gene entstehen können34,35,36. Daher spekulieren wir, dass das Intron von BjGRF im Laufe der Evolution verloren gegangen ist, was zu Veränderungen der Genfunktion führen könnte. In Übereinstimmung mit bestehenden Studien haben wir auch herausgefunden, dass die Anzahl der Introns mit der Genexpression zusammenhängt. Wenn ein Gen viele Introns hat, kann es schnell auf verschiedene ungünstige Faktoren reagieren.
Genduplikation ist ein wichtiger Faktor in der genomischen und genetischen Evolution37. Verwandte Studien haben gezeigt, dass Genduplikation nicht nur die Zahl der GRF-Gene erhöht, sondern auch als Mittel zur Erzeugung neuer Gene dient, die Pflanzen bei der Anpassung an verschiedene widrige Umweltbedingungen unterstützen38. In dieser Studie wurden insgesamt 48 doppelte Genpaare gefunden, bei denen es sich allesamt um segmentale Duplikationen handelte, was darauf hindeutet, dass segmentale Duplikationen der wichtigste Mechanismus zur Erhöhung der Genzahl in dieser Familie sind. In der Literatur wurde berichtet, dass segmentale Duplikation die Amplifikation von Mitgliedern der GRF-Genfamilie in Arabidopsis und Erdbeere wirksam fördern kann, wobei in keiner der Arten eine Tandemduplikation dieser Genfamilie festgestellt wurde27,39. Die Ergebnisse dieser Studie stehen im Einklang mit bestehenden Studien zu Arabidopsis thaliana und Erdbeerfamilien und legen nahe, dass die GRF-Familie durch segmentale Duplikation in verschiedenen Pflanzen die Zahl der Gene erhöhen und neue Gene erzeugen kann.
In dieser Studie wurden insgesamt 34 BjGRF-Gene in Senf identifiziert, die in 3 Unterfamilien unterteilt wurden. Diese Gene zeigten ähnliche konservierte Motive und Genstrukturen. Die Kollinearitätsanalyse ergab 48 Paare von Segmentduplikationen in Senf. Die BjGRF-Promoterregion enthält cis-wirkende Elemente, die mit Lichtreaktion, hormoneller Reaktion, Reaktion auf Umweltstress sowie Wachstum und Entwicklung verbunden sind. Die Expression von 34 BjGRF-Genen wurde im Senfkeimlingsstadium (Wurzeln, Stängel, Blätter) und das Expressionsmuster von 10 BjGRF-Genen unter Dürrebedingungen festgestellt. Es wurde festgestellt, dass die Expressionsmuster von BjGRF-Genen unter Dürrestress ähnlich waren und möglicherweise ähnlich sind. Beteiligung an der Dürreregulation. Die Gene BjGRF03 und BjGRF32 spielen möglicherweise eine positive regulatorische Rolle bei Dürrestress, während BjGRF06 und BjGRF23 als miR396-Zielgene bei Dürrestress eine Rolle spielen. Insgesamt liefert unsere Studie eine biologische Grundlage für die zukünftige Entdeckung der BjGRF-Genfunktion in Brassicaceae-Pflanzen.
Die für dieses Experiment verwendeten Senfkörner wurden vom Guizhou Oil Seed Research Institute der Guizhou Academy of Agricultural Sciences bereitgestellt. Die ganzen Samen wurden ausgewählt und in Erde gepflanzt (Substrat: Erde = 3:1). Nach dem Vierblattstadium wurden Wurzeln, Stängel und Blätter gesammelt. Die Pflanzen wurden mit 20 % PEG 6000 behandelt, um Trockenheit zu simulieren. Die Blätter wurden nach 0, 3, 6, 12 und 24 Stunden gesammelt. Alle Pflanzenproben wurden sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und anschließend für den nächsten Versuch in einem -80 °C-Gefrierschrank gelagert.
Alle im Rahmen dieser Studie gewonnenen oder analysierten Daten sind im veröffentlichten Artikel und in den ergänzenden Informationsdateien enthalten.
Veröffentlichungszeit: 22. Januar 2025