Der weitverbreitete Einsatz synthetischer Pestizide hat zu zahlreichen Problemen geführt, darunter die Entstehung resistenter Organismen, Umweltzerstörung und Gesundheitsschäden. Daher sind neue mikrobielle Pestizide von großer Bedeutung.PestizideEs besteht ein dringender Bedarf an Substanzen, die für die menschliche Gesundheit und die Umwelt unbedenklich sind. In dieser Studie wurde ein von Enterobacter cloacae SJ2 produziertes Rhamnolipid-Biosurfactant hinsichtlich seiner Toxizität gegenüber Mückenlarven (Culex quinquefasciatus) und Termitenlarven (Odontotermes obesus) untersucht. Die Ergebnisse zeigten eine dosisabhängige Mortalitätsrate. Der LC50-Wert (50 % letale Konzentration) nach 48 Stunden wurde für die Biosurfactants gegenüber Termiten- und Mückenlarven mittels nichtlinearer Regressionsanalyse bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass die LC50-Werte nach 48 Stunden (95 %-Konfidenzintervall) für die larvizide und termitenhemmende Wirkung des Biosurfactants 26,49 mg/L (Bereich: 25,40–27,57 mg/L) bzw. 33,43 mg/L (Bereich: 31,09–35,68 mg/L) betrugen. Laut histopathologischer Untersuchung führte die Behandlung mit Biosurfactants zu schweren Schäden an den Organellen von Larven und Termiten. Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass das von Enterobacter cloacae SJ2 produzierte mikrobielle Biosurfactant ein ausgezeichnetes und potenziell wirksames Mittel zur Bekämpfung von Cx. quinquefasciatus und O. obesus darstellt.
In tropischen Ländern treten zahlreiche durch Mücken übertragene Krankheiten auf1. Die Bedeutung dieser Krankheiten ist weitreichend. Jährlich sterben über 400.000 Menschen an Malaria, und in einigen Großstädten kommt es zu Epidemien schwerer Krankheiten wie Denguefieber, Gelbfieber, Chikungunya und Zika2. Vektorübertragene Krankheiten sind weltweit für jede sechste Infektion verantwortlich, wobei Mücken die meisten Fälle verursachen3,4. Culex, Anopheles und Aedes sind die drei Mückengattungen, die am häufigsten mit der Krankheitsübertragung in Verbindung gebracht werden5. Die Prävalenz von Denguefieber, einer durch die Gelbfiebermücke (Aedes aegypti) übertragenen Infektion, hat im letzten Jahrzehnt zugenommen und stellt eine erhebliche Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar4,7,8. Laut Weltgesundheitsorganisation (WHO) sind über 40 % der Weltbevölkerung von Denguefieber bedroht, und jährlich treten in über 100 Ländern 50–100 Millionen neue Fälle auf9,10,11. Denguefieber hat sich aufgrund seiner weltweit steigenden Inzidenz zu einem bedeutenden Problem für die öffentliche Gesundheit entwickelt12,13,14. Anopheles gambiae, allgemein bekannt als Afrikanische Anophelesmücke, ist der wichtigste Überträger von Malaria beim Menschen in tropischen und subtropischen Regionen15. Das West-Nil-Virus, die St.-Louis-Enzephalitis, die Japanische Enzephalitis sowie Virusinfektionen bei Pferden und Vögeln werden von Culex-Mücken, oft auch als Gemeine Stechmücken bezeichnet, übertragen. Darüber hinaus sind sie auch Überträger von bakteriellen und parasitären Erkrankungen16. Weltweit gibt es mehr als 3.000 Termitenarten, die seit über 150 Millionen Jahren existieren17. Die meisten Schädlinge leben im Boden und ernähren sich von Holz und zellulosehaltigen Holzprodukten. Die Indische Termite Odontotermes obesus ist ein bedeutender Schädling, der erhebliche Schäden an wichtigen Nutzpflanzen und Plantagenbäumen verursacht18. In landwirtschaftlichen Gebieten können Termitenbefälle in verschiedenen Stadien enorme wirtschaftliche Schäden an verschiedenen Nutzpflanzen, Baumarten und Baumaterialien anrichten. Termiten können auch beim Menschen gesundheitliche Probleme verursachen.19
Die Resistenzproblematik von Mikroorganismen und Schädlingen in der heutigen Pharma- und Agrarindustrie ist komplex20,21. Daher sollten beide Branchen nach neuen, kostengünstigen antimikrobiellen Mitteln und sicheren Biopestiziden suchen. Synthetische Pestizide sind zwar verfügbar, können aber infektiös sein und Nützlinge abwehren22. In den letzten Jahren hat die Forschung an Biosurfactants aufgrund ihrer vielfältigen Anwendungsmöglichkeiten in verschiedenen Branchen zugenommen. Biosurfactants sind in der Landwirtschaft, der Bodensanierung, der Erdölgewinnung, der Bakterien- und Insektenbekämpfung sowie der Lebensmittelverarbeitung von großem Nutzen und unverzichtbar23,24. Biosurfactants oder mikrobielle Tenside sind chemische Verbindungen, die von Mikroorganismen wie Bakterien, Hefen und Pilzen in Küstenhabitaten und ölverseuchten Gebieten produziert werden25,26. Chemisch hergestellte Tenside und Biosurfactants sind zwei Arten, die direkt aus der natürlichen Umwelt gewonnen werden27. Verschiedene Biosurfactants werden aus marinen Habitaten gewonnen28,29. Daher suchen Wissenschaftler nach neuen Technologien zur Herstellung von Biosurfactants auf Basis natürlicher Bakterien30,31. Fortschritte in der Forschung auf diesem Gebiet belegen die Bedeutung dieser biologischen Verbindungen für den Umweltschutz32. Bacillus, Pseudomonas, Rhodococcus, Alcaligenes, Corynebacterium und diese Bakteriengattungen sind gut untersuchte Vertreter23,33.
Es gibt zahlreiche Arten von Biosurfactants mit einem breiten Anwendungsspektrum34. Ein wesentlicher Vorteil dieser Verbindungen liegt in ihrer antibakteriellen, larviziden und insektiziden Wirkung. Dadurch eignen sie sich für den Einsatz in der Landwirtschaft, der chemischen, pharmazeutischen und kosmetischen Industrie35,36,37,38. Da Biosurfactants im Allgemeinen biologisch abbaubar und umweltverträglich sind, werden sie in integrierten Schädlingsbekämpfungsprogrammen zum Schutz von Nutzpflanzen eingesetzt39. Es wurden grundlegende Erkenntnisse über die larvizide und termitenhemmende Wirkung mikrobieller Biosurfactants gewonnen, die von Enterobacter cloacae SJ2 produziert werden. Wir untersuchten die Mortalität und histologische Veränderungen nach Exposition gegenüber verschiedenen Konzentrationen von Rhamnolipid-Biosurfactants. Zusätzlich evaluierten wir das weit verbreitete QSAR-Computerprogramm ECOSAR (Ecological Structure-Activity), um die akute Toxizität für Mikroalgen, Daphnien und Fische zu bestimmen.
In dieser Studie wurde die Antitermitenwirkung (Toxizität) gereinigter Biosurfactants in verschiedenen Konzentrationen von 30 bis 50 mg/ml (in 5-mg/ml-Schritten) gegen Indische Termiten, O. obesus und Larven der Mückenart Cx. quinquefasciatus getestet. Die LC50-Konzentrationen der Biosurfactants wurden über 48 Stunden gegen O. obesus und Cx. solanacearum bestimmt. Die Mückenlarven wurden mittels nichtlinearer Regressionsanalyse identifiziert. Die Ergebnisse zeigten, dass die Termitensterblichkeit mit steigender Biosurfactant-Konzentration zunahm. Die Ergebnisse zeigten, dass das Biosurfactant larvizide (Abbildung 1) und termitenabweisende Wirkung (Abbildung 2) aufwies, mit LC50-Werten nach 48 Stunden (95 %-Konfidenzintervall) von 26,49 mg/l (25,40 bis 27,57) bzw. 33,43 mg/l (31,09 bis 35,68) (Tabelle 1). Hinsichtlich der akuten Toxizität (48 Stunden) wird das Biosurfactant als „schädlich“ für die getesteten Organismen eingestuft. Das in dieser Studie hergestellte Biosurfactant zeigte eine ausgezeichnete larvizide Wirkung mit 100 % Mortalität innerhalb von 24–48 Stunden Expositionszeit.
Berechnen Sie den LC50-Wert für die larvizide Wirkung. Nichtlineare Regressionskurvenanpassung (durchgezogene Linie) und 95%-Konfidenzintervall (schattierter Bereich) für die relative Mortalität (%).
Berechnen Sie den LC50-Wert für die Wirksamkeit gegen Termiten. Nichtlineare Regressionskurvenanpassung (durchgezogene Linie) und 95%-Konfidenzintervall (schattierter Bereich) für die relative Mortalität (%).
Am Ende des Experiments wurden morphologische Veränderungen und Anomalien mikroskopisch untersucht. Diese Veränderungen waren in der Kontroll- und der Behandlungsgruppe bei 40-facher Vergrößerung sichtbar. Wie in Abbildung 3 dargestellt, war das Wachstum der meisten mit Biosurfactants behandelten Larven beeinträchtigt. Abbildung 3a zeigt eine normale Cx. quinquefasciatus-Larve, Abbildung 3b eine anomale. Fünf Nematodenlarven wurden untersucht.
Wirkung subletaler (LC50) Dosen von Biosurfactants auf die Entwicklung von Culex quinquefasciatus-Larven. Lichtmikroskopische Aufnahme (a) eines normalen Culex quinquefasciatus bei 40-facher Vergrößerung. (b) Abnormer Culex quinquefasciatus. Schlüpft in fünf Nematodenlarven.
Die histologische Untersuchung behandelter Larven (Abb. 4) und Termiten (Abb. 5) zeigte in der vorliegenden Studie mehrere Anomalien, darunter eine Verkleinerung des Abdomens und Schädigungen der Muskulatur, der Epithelschichten und der Haut des Mitteldarms. Die Histologie klärte den Wirkmechanismus des in dieser Studie verwendeten Biosurfactants auf.
Histopathologie normaler, unbehandelter Larven des 4. Larvenstadiums von *Cx quinquefasciatus* (Kontrolle: (a, b)) und mit Biosurfactant behandelter Larven (Behandlung: (c, d)). Pfeile markieren behandeltes Darmepithel (epi), Zellkerne (n) und Muskelgewebe (mu). Maßstab = 50 µm.
Histopathologie von unbehandelten O. obesus (Kontrolle: (a, b)) und mit Biosurfactant behandelten Tieren (Behandlung: (c, d)). Pfeile markieren Darmepithel (epi) bzw. Muskelgewebe (mu). Maßstab = 50 µm.
In dieser Studie wurde ECOSAR verwendet, um die akute Toxizität von Rhamnolipid-Biosurfactant-Produkten gegenüber Primärproduzenten (Grünalgen), Primärkonsumenten (Wasserflöhen) und Sekundärkonsumenten (Fischen) vorherzusagen. Dieses Programm verwendet komplexe quantitative Struktur-Wirkungs-Modelle, um die Toxizität anhand der Molekülstruktur zu bewerten. Das Modell nutzt Struktur-Wirkungs-Software (SAR), um die akute und langfristige Toxizität von Substanzen für Wasserorganismen zu berechnen. Tabelle 2 fasst die geschätzten mittleren letalen Konzentrationen (LC50) und mittleren effektiven Konzentrationen (EC50) für verschiedene Arten zusammen. Die vermutete Toxizität wurde anhand des Global Harmonisierten Systems zur Einstufung und Kennzeichnung von Chemikalien (GHS) in vier Stufen kategorisiert (Tabelle 3).
Die Bekämpfung von durch Vektoren übertragenen Krankheiten, insbesondere von Stechmückenstämmen und Aedes-Mücken, stellt die Ägypter vor große Herausforderungen (40,41,42,43,44,45,46). Obwohl einige chemisch verfügbare Pestizide wie Pyrethroide und Organophosphate gewisse Vorteile bieten, bergen sie erhebliche Risiken für die menschliche Gesundheit, darunter Diabetes, Fortpflanzungsstörungen, neurologische Erkrankungen, Krebs und Atemwegserkrankungen. Zudem können Insekten mit der Zeit Resistenzen entwickeln (13,43,48). Daher werden wirksame und umweltfreundliche biologische Bekämpfungsmaßnahmen zunehmend an Bedeutung gewinnen (49,50). Benelli (51) schlug vor, die frühzeitige Bekämpfung von Stechmücken als Vektoren in städtischen Gebieten zu priorisieren, empfahl jedoch nicht den Einsatz von Larviziden in ländlichen Gebieten (52). Tom et al. (53) argumentierten ebenfalls, dass die Bekämpfung von Stechmücken in ihren Larvenstadien eine sichere und einfache Strategie sei, da diese empfindlicher auf Bekämpfungsmittel reagieren (54).
Die Biosurfactant-Produktion durch einen potenten Stamm (Enterobacter cloacae SJ2) zeigte eine konsistente und vielversprechende Wirksamkeit. Unsere vorherige Studie berichtete, dass Enterobacter cloacae SJ2 die Biosurfactant-Produktion durch physikochemische Parameter optimiert26. Laut dieser Studie waren die optimalen Bedingungen für die Biosurfactant-Produktion durch ein potenzielles E. cloacae-Isolat 36 Stunden Inkubation, Schütteln bei 150 U/min, pH 7,5, 37 °C, 1 ppt Salzgehalt, 2 % Glucose als Kohlenstoffquelle und 1 % Hefe. Der Extrakt wurde als Stickstoffquelle verwendet, um 2,61 g/L Biosurfactant zu erhalten. Zusätzlich wurden die Biosurfactants mittels Dünnschichtchromatographie (DC), Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FTIR) und MALDI-TOF-Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) charakterisiert. Dies bestätigte, dass es sich bei dem Biosurfactant um Rhamnolipid handelt. Glykolipid-Biosurfactants sind die am intensivsten untersuchte Klasse der Biosurfactants55. Sie bestehen aus Kohlenhydrat- und Lipidanteilen, hauptsächlich Fettsäureketten. Unter den Glykolipiden zählen Rhamnolipid und Sophorolipid zu den wichtigsten Vertretern56. Rhamnolipide enthalten zwei Rhamnose-Einheiten, die an Mono- oder Di-β-Hydroxydecansäure gebunden sind57. Ihre Verwendung in der Medizin und Pharmazie ist etabliert58, ebenso wie ihr Einsatz als Pestizide59.
Die Wechselwirkung des Biosurfactants mit der hydrophoben Region des Atmungssiphons ermöglicht den Wasserdurchtritt durch die Spaltöffnungen und erhöht so den Kontakt der Larven mit der aquatischen Umgebung. Die Anwesenheit von Biosurfactants beeinflusst auch die Tracheen, deren Länge nahe der Wasseroberfläche liegt, wodurch es den Larven erleichtert wird, zur Oberfläche zu kriechen und zu atmen. Infolgedessen sinkt die Oberflächenspannung des Wassers. Da sich die Larven nicht an der Wasseroberfläche festhalten können, sinken sie auf den Beckenboden, wodurch der hydrostatische Druck gestört wird. Dies führt zu übermäßigem Energieaufwand und schließlich zum Tod durch Ertrinken.38,60 Ähnliche Ergebnisse erzielte Ghribi61, dessen Biosurfactant, produziert von Bacillus subtilis, larvizide Wirkung gegen Ephestia kuehniella zeigte. Auch Das und Mukherjee23 untersuchten die larvizide Wirkung von cyclischen Lipopeptiden auf Quinquefasciatus-Larven.
Die Ergebnisse dieser Studie betreffen die larvizide Wirkung von Rhamnolipid-Biosurfactants gegen Cx. quinquefasciatus-Mücken. Die Abtötung von Cx. quinquefasciatus-Mücken stimmt mit zuvor veröffentlichten Ergebnissen überein. Beispielsweise werden Surfactin-basierte Biosurfactants verwendet, die von verschiedenen Bakterien der Gattung Bacillus produziert werden. Einige frühere Berichte64,65,66 berichteten über die larvenabtötende Wirkung von Lipopeptid-Biosurfactants aus Bacillus subtilis23. Deepali et al.63 fanden heraus, dass ein aus Stenotropomonas maltophilia isoliertes Rhamnolipid-Biosurfactant bei einer Konzentration von 10 mg/L eine starke larvizide Wirkung aufwies. Silva et al.67 berichteten über die larvizide Wirkung eines Rhamnolipid-Biosurfactants gegen Ae. aegypti bei einer Konzentration von 1 g/L. Kanakdande et al. 68 berichteten, dass Lipopeptid-Biosurfactants, die von Bacillus subtilis produziert werden, bei Culex-Larven und Termiten durch die lipophile Fraktion von Eukalyptus eine Gesamtmortalität verursachten. Ähnlich berichteten Masendra et al. 69 über eine Mortalität von 61,7 % bei Arbeiterameisen (Cryptotermes cynocephalus Light.) in den lipophilen n-Hexan- und EtOAc-Fraktionen des Rohextrakts von Eukalyptus.
Parthipan et al. berichteten über die insektizide Wirkung von Lipopeptid-Biosurfactants, die von Bacillus subtilis A1 und Pseudomonas stutzeri NA3 produziert werden, gegen Anopheles sthengesi, einen Überträger des Malariaerregers Plasmodium. Sie beobachteten, dass Larven und Puppen nach Behandlung mit verschiedenen Biosurfactant-Konzentrationen länger überlebten, kürzere Eiablageperioden aufwiesen, steril waren und eine kürzere Lebensdauer hatten. Die ermittelten LC50-Werte des B. subtilis-Biosurfactants A1 betrugen 3,58, 4,92, 5,37, 7,10 und 7,99 mg/L für die verschiedenen Larvenstadien (Larven I, II, III, IV und Puppen). Im Vergleich dazu betrugen die Biosurfactant-Konzentrationen für die Larvenstadien I–IV und die Puppenstadien von Pseudomonas stutzeri NA3 2,61, 3,68, 4,48, 5,55 bzw. 6,99 mg/L. Die verzögerte Phänologie der überlebenden Larven und Puppen wird auf signifikante physiologische und metabolische Störungen zurückgeführt, die durch die Insektizidbehandlungen verursacht wurden71.
Der Stamm CCMA 0358 von Wickerhamomyces anomalus produziert ein Biosurfactant mit 100%iger larvizider Wirkung gegen Aedes-Mücken. Das 24-Stunden-Intervall von 38 gegen Aedes aegypti war höher als von Silva et al. berichtet. Ein aus Pseudomonas aeruginosa mit Sonnenblumenöl als Kohlenstoffquelle hergestelltes Biosurfactant tötete nachweislich 100 % der Larven innerhalb von 48 Stunden ab67. Abinaya et al.72 und Pradhan et al.73 wiesen ebenfalls die larvizide bzw. insektizide Wirkung von Tensiden nach, die von verschiedenen Isolaten der Gattung Bacillus produziert werden. Eine zuvor veröffentlichte Studie von Senthil-Nathan et al. zeigte, dass 100 % der Mückenlarven, die Pflanzenteichen ausgesetzt waren, wahrscheinlich starben74.
Die Bewertung der subletalen Wirkungen von Insektiziden auf die Insektenbiologie ist für integrierte Schädlingsbekämpfungsprogramme von entscheidender Bedeutung, da subletale Dosen/Konzentrationen Insekten zwar nicht töten, aber durch die Beeinträchtigung biologischer Merkmale die Insektenpopulationen zukünftiger Generationen reduzieren können10. Siqueira et al.75 beobachteten eine vollständige larvizide Wirkung (100 % Mortalität) des Rhamnolipid-Biosurfactants (300 mg/ml) bei Tests in verschiedenen Konzentrationen von 50 bis 300 mg/ml an Larvenstadien von Aedes aegypti-Stämmen. Sie analysierten die Auswirkungen der Zeit bis zum Tod und subletaler Konzentrationen auf das Überleben und die Schwimmaktivität der Larven. Darüber hinaus beobachteten sie eine Verringerung der Schwimmgeschwindigkeit nach 24–48 Stunden Exposition gegenüber subletalen Konzentrationen des Biosurfactants (z. B. 50 mg/ml und 100 mg/ml). Gifte mit vielversprechenden subletalen Wirkungen scheinen wirksamer zu sein, um exponierten Schädlingen vielfältige Schäden zuzufügen76.
Histologische Untersuchungen unserer Ergebnisse deuten darauf hin, dass von Enterobacter cloacae SJ2 produzierte Biosurfactants das Gewebe von Mückenlarven (Cx. quinquefasciatus) und Termitenlarven (O. obesus) signifikant verändern. Ähnliche Anomalien wurden durch Basilikumölpräparate bei An. gambiaes und An. arabica beschrieben (Ochola77). Kamaraj et al.78 beschrieben ebenfalls dieselben morphologischen Anomalien bei An. Stephanie-Larven nach Exposition gegenüber Goldnanopartikeln. Vasantha-Srinivasan et al.79 berichteten zudem, dass Hirtentäschelöl die Kammer und die Epithelschichten von Aedes albopictus, Aedes aegypti und Cx. aegypti stark schädigte. Raghavendran et al. berichteten, dass Mückenlarven nach Behandlung mit 500 mg/ml Myzelextrakt eines lokalen Penicillium-Pilzes schwere histologische Schäden aufwiesen. Mortalitätsrate 80. Zuvor untersuchten Abinaya et al. Larven des vierten Stadiums von An. Stephensi und Ae. aegypti fanden zahlreiche histologische Veränderungen in mit B. licheniformis-Exopolysacchariden behandelten Aedes aegypti, darunter Veränderungen des Magen- und Zäkums, Muskelatrophie sowie Schädigungen und Desorganisation der Nervenstrangganglien72. Laut Raghavendran et al. zeigten die Mitteldarmzellen der getesteten Mücken (Larven des vierten Stadiums) nach Behandlung mit P. daleae-Myzelextrakt eine Schwellung des Darmlumens, eine Abnahme des Interzellularinhalts und Kerndegeneration81. Dieselben histologischen Veränderungen wurden in mit Echinacea-Blattextrakt behandelten Mückenlarven beobachtet, was auf das insektizide Potenzial der behandelten Verbindungen hinweist50.
Die Anwendung der ECOSAR-Software hat internationale Anerkennung gefunden82. Aktuelle Forschungsergebnisse deuten darauf hin, dass die akute Toxizität von ECOSAR-Biosurfactants gegenüber Mikroalgen (C. vulgaris), Fischen und Wasserflöhen (D. magna) in die von den Vereinten Nationen definierte Kategorie „Toxizität“ fällt83. Das ECOSAR-Ökotoxizitätsmodell verwendet SAR und QSAR zur Vorhersage der akuten und langfristigen Toxizität von Substanzen und wird häufig zur Vorhersage der Toxizität organischer Schadstoffe eingesetzt82,84.
Paraformaldehyd, Natriumphosphatpuffer (pH 7,4) und alle anderen in dieser Studie verwendeten Chemikalien wurden von HiMedia Laboratories, Indien, bezogen.
Die Biosurfactant-Produktion erfolgte in 500-ml-Erlenmeyerkolben mit 200 ml sterilem Bushnell-Haas-Medium, dem 1 % Rohöl als einzige Kohlenstoffquelle zugesetzt war. Eine Vorkultur von Enterobacter cloacae SJ2 (1,4 × 10⁴ KBE/ml) wurde angeimpft und 7 Tage lang bei 37 °C und 200 U/min auf einem Orbitalschüttler inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Biosurfactant durch Zentrifugation des Kulturmediums bei 3400 × g für 20 min bei 4 °C extrahiert. Der resultierende Überstand wurde für das Screening verwendet. Die Optimierungsverfahren und die Charakterisierung der Biosurfactants wurden aus unserer früheren Studie26 übernommen.
Larven der Art Culex quinquefasciatus wurden vom Center for Advanced Study in Marine Biology (CAS) in Palanchipetai, Tamil Nadu (Indien), bezogen. Die Larven wurden in mit deionisiertem Wasser gefüllten Plastikbehältern bei 27 ± 2 °C und einem Licht-Dunkel-Zyklus von 12:12 Stunden aufgezogen. Sie wurden mit einer 10%igen Glucoselösung gefüttert.
Larven von Culex quinquefasciatus wurden in offenen und ungeschützten Klärgruben gefunden. Zur Identifizierung und Kultivierung der Larven im Labor sind Standardklassifizierungsrichtlinien zu verwenden85. Larvizidversuche wurden gemäß den Empfehlungen der Weltgesundheitsorganisation durchgeführt86. SH. Larven des vierten Larvenstadiums von Culex quinquefasciatus wurden in geschlossenen Röhrchen in Gruppen von 25 ml und 50 ml mit einem Luftspalt von zwei Dritteln des jeweiligen Volumens gesammelt. Jedem Röhrchen wurde einzeln Biosurfactant (0–50 mg/ml) zugesetzt und die Röhrchen wurden bei 25 °C gelagert. Das Kontrollröhrchen enthielt lediglich destilliertes Wasser (50 ml). Als tot galten Larven, die während der Inkubationszeit (12–48 Stunden) keine Schwimmzeichen zeigten87. Die Larvensterblichkeit in Prozent wurde mithilfe der Gleichung (1) berechnet88.
Die Familie Odontotermitidae umfasst die Indische Termite Odontotermes obesus, die auf dem Gelände des Landwirtschaftlichen Campus (Annamalai-Universität, Indien) in verrottenden Baumstämmen vorkommt. Dieses Biosurfactant (0–50 mg/ml) wurde nach Standardverfahren auf seine Schädlichkeit getestet. Nach 30-minütiger Trocknung in einem laminaren Luftstrom wurde jeder Streifen Whatman-Papier mit Biosurfactant in Konzentrationen von 30, 40 oder 50 mg/ml beschichtet. Beschichtete und unbeschichtete Papierstreifen wurden in der Mitte einer Petrischale getestet und verglichen. Jede Petrischale enthielt etwa dreißig aktive Termiten der Art O. obesus. Kontroll- und Testtermiten erhielten feuchtes Papier als Nahrung. Alle Petrischalen wurden während der gesamten Inkubationszeit bei Raumtemperatur aufbewahrt. Die Termiten starben nach 12, 24, 36 und 48 Stunden89,90. Anschließend wurde Gleichung 1 verwendet, um die prozentuale Termitensterblichkeit bei verschiedenen Biosurfactant-Konzentrationen zu schätzen. (2)
Die Proben wurden auf Eis gelagert und in Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,4) verpackt. Anschließend wurden sie zur weiteren Analyse an das Zentrale Labor für Aquakulturpathologie (CAPL) des Rajiv Gandhi Zentrums für Aquakultur (RGCA), Histologisches Labor, Sirkali, Distrikt Mayiladuthurai, Tamil Nadu, Indien, geschickt. Die Proben wurden sofort in 4%igem Paraformaldehyd bei 37 °C für 48 Stunden fixiert.
Nach der Fixierungsphase wurde das Material dreimal mit 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,4) gewaschen, schrittweise in Ethanol entwässert und 7 Tage lang in LEICA-Harz eingebettet. Anschließend wurde die Substanz in eine mit Harz und Polymerisator gefüllte Kunststoffform gegeben und in einem auf 37 °C vorgeheizten Ofen bis zur vollständigen Polymerisation des Blocks polymerisiert.
Nach der Polymerisation wurden die Blöcke mit einem LEICA RM2235 Mikrotom (Rankin Biomedical Corporation, 10399 Enterprise Dr., Davisburg, MI 48350, USA) in 3 mm dicke Schnitte geschnitten. Die Schnitte wurden auf Objektträgern gruppiert (sechs Schnitte pro Objektträger). Die Objektträger wurden bei Raumtemperatur getrocknet, anschließend 7 Minuten lang mit Hämatoxylin gefärbt und 4 Minuten lang unter fließendem Wasser gespült. Zusätzlich wurde die Haut 5 Minuten lang mit Eosinlösung behandelt und anschließend 5 Minuten lang unter fließendem Wasser abgespült.
Die akute Toxizität wurde anhand von Wasserorganismen verschiedener tropischer Regionen vorhergesagt: 96-Stunden-LC50 für Fische, 48-Stunden-LC50 für Daphnia magna und 96-Stunden-EC50 für Grünalgen. Die Toxizität von Rhamnolipid-Biosurfactants gegenüber Fischen und Grünalgen wurde mit der Software ECOSAR Version 2.2 für Windows der US-Umweltschutzbehörde (EPA) bewertet (verfügbar unter https://www.epa.gov/tsca-screening-tools/ecological-struct-activity-relationships-ecosar-predictive-model).
Alle Tests zur larviziden und termitenhemmenden Wirkung wurden dreifach durchgeführt. Zur Berechnung der medianen letalen Konzentration (LC50) mit 95%-Konfidenzintervall wurde eine nichtlineare Regression (Logarithmus der Dosis-Wirkungs-Variablen) der Larven- und Termitenmortalitätsdaten durchgeführt. Die Konzentrations-Wirkungs-Kurven wurden mit Prism® (Version 8.0, GraphPad Software Inc., USA) erstellt.84, 91
Die vorliegende Studie zeigt das Potenzial mikrobieller Biosurfactants, die von Enterobacter cloacae SJ2 produziert werden, als Larvizide gegen Stechmücken und Termiten auf. Diese Arbeit trägt zu einem besseren Verständnis der Wirkmechanismen dieser Substanzen bei. Histologische Untersuchungen von mit Biosurfactants behandelten Larven zeigten Schäden am Verdauungstrakt, Mitteldarm und der Großhirnrinde sowie eine Hyperplasie der Darmepithelzellen. Ergebnisse: Die toxikologische Bewertung der termiten- und larviziden Wirkung des von Enterobacter cloacae SJ2 produzierten Rhamnolipid-Biosurfactants ergab, dass dieses Isolat ein potenzielles Biopestizid zur Bekämpfung von durch Vektoren übertragenen Krankheiten bei Stechmücken (Cx quinquefasciatus) und Termiten (O. obesus) darstellt. Es besteht Bedarf, die zugrundeliegende Umwelttoxizität von Biosurfactants und ihre potenziellen Umweltauswirkungen zu verstehen. Diese Studie liefert eine wissenschaftliche Grundlage für die Bewertung des Umweltrisikos von Biosurfactants.
Veröffentlichungsdatum: 09.04.2024