Diese Studie untersuchte die Letalität, Subletalität und Toxizität von kommerziellenCypermethrinFormulierungen an Anurenkaulquappen. Im Akuttest wurden Konzentrationen von 100 bis 800 μg/l 96 Stunden lang getestet. Im chronischen Test wurden natürlich vorkommende Cypermethrinkonzentrationen (1, 3, 6 und 20 μg/l) auf Mortalität getestet, gefolgt von einem Mikronukleustest und der Untersuchung auf Kernanomalien der roten Blutkörperchen über 7 Tage. Die LC50 der kommerziellen Cypermethrinformulierung für Kaulquappen betrug 273,41 μg L−1. Im chronischen Test führte die höchste Konzentration (20 μg L−1) zu einer Mortalität von über 50 %, da sie die Hälfte der getesteten Kaulquappen tötete. Der Mikronukleustest zeigte signifikante Ergebnisse bei 6 und 20 μg L−1 und es wurden mehrere Kernanomalien entdeckt, was darauf hindeutet, dass die kommerzielle Cypermethrinformulierung genotoxisches Potenzial gegen P. gracilis hat. Cypermethrin stellt ein hohes Risiko für diese Art dar. Es kann vielfältige Probleme verursachen und die Dynamik dieses Ökosystems kurz- und langfristig beeinträchtigen. Daher kann der Schluss gezogen werden, dass kommerzielle Cypermethrin-Formulierungen toxische Wirkungen auf P. gracilis haben.
Durch die kontinuierliche Ausweitung der landwirtschaftlichen Aktivitäten und die intensive Nutzung vonSchädlingsbekämpfungMaßnahmen sind Wassertiere häufig Pestiziden ausgesetzt.1,2 Die Verschmutzung von Wasserressourcen in der Nähe landwirtschaftlicher Felder kann die Entwicklung und das Überleben von Nichtzielorganismen wie Amphibien beeinträchtigen.
Amphibien gewinnen bei der Bewertung von Umweltmatrizen zunehmend an Bedeutung. Anuren gelten aufgrund ihrer einzigartigen Eigenschaften wie komplexer Lebenszyklen, schnellem Larvenwachstum, trophischem Status, durchlässiger Haut10,11, Abhängigkeit von Wasser zur Fortpflanzung12 und ungeschützten Eiern11,13,14 als gute Bioindikatoren für Umweltschadstoffe. Der Kleine Wasserfrosch (Physalaemus gracilis), allgemein bekannt als der Hängefrosch, hat sich als Bioindikatorart für Pestizidverschmutzung4,5,6,7,15 erwiesen. Die Art kommt in stehenden Gewässern, Schutzgebieten oder Gebieten mit variablem Lebensraum in Argentinien, Uruguay, Paraguay und Brasilien1617 vor und wird von der IUCN-Klassifikation aufgrund ihrer weiten Verbreitung und Toleranz gegenüber unterschiedlichen Lebensräumen18 als stabil eingestuft.
Bei Amphibien wurden nach Cypermethrin-Exposition subletale Effekte beobachtet, darunter Verhaltens-, morphologische und biochemische Veränderungen bei Kaulquappen23,24,25, veränderte Mortalität und Metamorphosezeit, enzymatische Veränderungen, verringerte Schlupfrate24,25, Hyperaktivität26, Hemmung der Cholinesteraseaktivität27 und Veränderungen der Schwimmleistung7,28. Studien zu den genotoxischen Wirkungen von Cypermethrin bei Amphibien sind jedoch begrenzt. Daher ist es wichtig, die Empfindlichkeit von Anurenarten gegenüber Cypermethrin zu untersuchen.
Umweltverschmutzung beeinträchtigt das normale Wachstum und die Entwicklung von Amphibien. Die schwerwiegendste Folge sind jedoch genetische Schäden an der DNA durch Pestizidexposition13. Die Analyse der Blutzellmorphologie ist ein wichtiger Bioindikator für Verschmutzung und potenzielle Toxizität einer Substanz für Wildtiere29. Der Mikronukleustest ist eine der am häufigsten verwendeten Methoden zur Bestimmung der Genotoxizität von Chemikalien in der Umwelt30. Er ist eine schnelle, effektive und kostengünstige Methode, die ein guter Indikator für die chemische Verschmutzung von Organismen wie Amphibien31,32 ist und Informationen über die Belastung mit genotoxischen Schadstoffen liefern kann33.
Das Ziel dieser Studie bestand darin, das toxische Potenzial kommerzieller Cypermethrin-Formulierungen für kleine Kaulquappen im Wasser mithilfe eines Mikronukleustests und einer ökologischen Risikobewertung zu bewerten.
Kumulative Mortalität (%) von P. gracilis-Kaulquappen, die während der akuten Testphase unterschiedlichen Konzentrationen von handelsüblichem Cypermethrin ausgesetzt waren.
Kumulative Mortalität (%) von P. gracilis-Kaulquappen, die während eines chronischen Tests unterschiedlichen Konzentrationen von handelsüblichem Cypermethrin ausgesetzt waren.
Die beobachtete hohe Sterblichkeit war das Ergebnis genotoxischer Effekte bei Amphibien, die unterschiedlichen Cypermethrin-Konzentrationen (6 und 20 μg/l) ausgesetzt waren, wie das Vorhandensein von Mikronuklei (MN) und Kernanomalien in Erythrozyten belegt. Die Bildung von MN weist auf Fehler bei der Mitose hin und ist mit mangelhafter Bindung von Chromosomen an Mikrotubuli, Defekten in Proteinkomplexen, die für Chromosomenaufnahme und -transport verantwortlich sind, Fehlern bei der Chromosomensegregation und Fehlern bei der DNA-Reparatur verbunden38,39 und kann mit pestizidinduziertem oxidativem Stress zusammenhängen40,41. Bei allen untersuchten Konzentrationen wurden weitere Anomalien beobachtet. Steigende Cypermethrin-Konzentrationen erhöhten die Kernanomalien in Erythrozyten um 5 % bzw. 20 % bei der niedrigsten (1 μg/l) und höchsten (20 μg/l) Dosis. So können beispielsweise Veränderungen der DNA einer Art schwerwiegende Folgen für das kurz- und langfristige Überleben haben und zu Populationsrückgang, veränderter reproduktiver Fitness, Inzucht, Verlust genetischer Vielfalt und veränderten Migrationsraten führen. Alle diese Faktoren können das Überleben und den Erhalt der Art beeinträchtigen42,43. Die Bildung erythroider Anomalien kann auf eine Blockade der Zytokinese hinweisen, die zu einer abnormalen Zellteilung (zweikernige Erythrozyten)44,45 führt. Mehrlappige Kerne sind Ausstülpungen der Kernmembran mit mehreren Lappen46, während andere erythroide Anomalien mit einer DNA-Amplifikation einhergehen können, wie z. B. Kernnieren/Kernbläschen47. Das Vorhandensein kernloser Erythrozyten kann auf einen beeinträchtigten Sauerstofftransport hinweisen, insbesondere in kontaminiertem Wasser48,49. Apoptose weist auf Zelltod hin50.
Auch andere Studien haben die genotoxischen Wirkungen von Cypermethrin nachgewiesen. Kabaña et al.51 wiesen das Vorhandensein von Mikrokernen und Kernveränderungen wie zweikernigen Zellen und apoptotischen Zellen in Zellen von Odontophrynus americanus nach Exposition gegenüber hohen Cypermethrinkonzentrationen (5000 und 10.000 μg L−1) für 96 Stunden nach. Cypermethrin-induzierte Apoptose wurde auch bei P. biligonigerus52 und Rhinella arenarum53 festgestellt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Cypermethrin genotoxische Wirkungen auf eine Reihe von Wasserorganismen hat und dass der MN- und ENA-Test ein Indikator für subletale Wirkungen auf Amphibien sein könnte und auf einheimische Arten und Wildpopulationen anwendbar sein könnte, die Giftstoffen ausgesetzt sind12.
Kommerzielle Formulierungen von Cypermethrin stellen eine große Gefahr für die Umwelt dar (sowohl akut als auch chronisch), wobei die HQs die Grenzwerte der US-Umweltschutzbehörde (EPA) überschreiten54, was die Art bei Vorhandensein in der Umwelt negativ beeinflussen kann. Bei der Bewertung des chronischen Risikos lag der NOEC für die Mortalität bei 3 μg L−1, was bestätigt, dass die im Wasser festgestellten Konzentrationen ein Risiko für die Art darstellen können55. Der letale NOEC für R. arenarum-Larven, die einer Mischung aus Endosulfan und Cypermethrin ausgesetzt waren, lag nach 168 Stunden bei 500 μg L−1; dieser Wert sank nach 336 Stunden auf 0,0005 μg L−1. Die Autoren zeigen, dass die für die Art schädlichen Konzentrationen umso geringer sind, je länger die Exposition ist. Außerdem ist es wichtig hervorzuheben, dass die NOEC-Werte höher waren als die von P. gracilis zur gleichen Expositionszeit, was darauf hindeutet, dass die Artreaktion auf Cypermethrin artspezifisch ist. Was die Sterblichkeit betrifft, erreichte der CHQ-Wert von P. gracilis nach Cypermethrin-Exposition 64,67 und lag damit über dem von der US-Umweltschutzbehörde festgelegten Referenzwert54. Auch der CHQ-Wert der Larven von R. arenarum lag über diesem Wert (CHQ > 388,00 nach 336 Stunden). Dies weist darauf hin, dass die untersuchten Insektizide ein hohes Risiko für mehrere Amphibienarten darstellen. In Anbetracht der Tatsache, dass P. gracilis für die vollständige Metamorphose etwa 30 Tage benötigt56, kann der Schluss gezogen werden, dass die untersuchten Cypermethrin-Konzentrationen zum Populationsrückgang beitragen könnten, indem sie infizierte Individuen daran hindern, frühzeitig das Erwachsenen- oder Fortpflanzungsstadium zu erreichen.
Die berechnete Risikobewertung von Mikronuklei und anderen Erythrozytenkernanomalien ergab CHQ-Werte zwischen 14,92 und 97,00. Dies deutet darauf hin, dass Cypermethrin selbst in seinem natürlichen Lebensraum ein potenzielles genotoxisches Risiko für P. gracilis darstellt. Unter Berücksichtigung der Mortalität betrug die für P. gracilis maximal tolerierbare Konzentration xenobiotischer Verbindungen 4,24 μg/l. Allerdings zeigten bereits Konzentrationen von 1 μg/l genotoxische Effekte. Dies kann zu einem Anstieg der Anzahl abnormaler Individuen57 führen und die Entwicklung und Fortpflanzung von Arten in ihren Lebensräumen beeinträchtigen, was zu einem Rückgang der Amphibienpopulationen führt.
Kommerzielle Formulierungen des Insektizids Cypermethrin zeigten eine hohe akute und chronische Toxizität gegenüber P. gracilis. Es wurden höhere Mortalitätsraten beobachtet, wahrscheinlich aufgrund toxischer Wirkungen, wie das Vorhandensein von Mikrokernen und Erythrozytenkernanomalien, insbesondere gezähnten, gelappten und vesikulären Kernen, belegt. Darüber hinaus wiesen die untersuchten Arten erhöhte akute und chronische Umweltrisiken auf. Diese Daten, kombiniert mit früheren Studien unserer Forschungsgruppe, zeigten, dass selbst verschiedene kommerzielle Formulierungen von Cypermethrin noch immer eine verringerte Acetylcholinesterase (AChE)- und Butyrylcholinesterase (BChE)-Aktivität sowie oxidativen Stress58 verursachten und bei P. gracilis Veränderungen der Schwimmaktivität und orale Missbildungen59 verursachten, was darauf hindeutet, dass kommerzielle Formulierungen von Cypermethrin für diese Art eine hohe letale und subletale Toxizität aufweisen. Hartmann et al. 60 stellten fest, dass kommerzielle Cypermethrin-Formulierungen im Vergleich zu neun anderen Pestiziden am giftigsten für P. gracilis und eine andere Art derselben Gattung (P. cuvieri) waren. Dies deutet darauf hin, dass gesetzlich zugelassene Cypermethrin-Konzentrationen zum Schutz der Umwelt zu einer hohen Sterblichkeit und einem langfristigen Populationsrückgang führen können.
Weitere Studien sind erforderlich, um die Toxizität des Pestizids für Amphibien zu beurteilen, da die in der Umwelt gefundenen Konzentrationen eine hohe Sterblichkeit verursachen und ein potenzielles Risiko für P. gracilis darstellen können. Die Forschung an Amphibienarten sollte gefördert werden, da Daten zu diesen Organismen, insbesondere zu brasilianischen Arten, rar sind.
Der chronische Toxizitätstest dauerte 168 Stunden (7 Tage) unter statischen Bedingungen. Die subletalen Konzentrationen betrugen: 1, 3, 6 und 20 μg ai L−1. In beiden Experimenten wurden 10 Kaulquappen pro Behandlungsgruppe mit sechs Wiederholungen untersucht, insgesamt also 60 Kaulquappen pro Konzentration. Die reine Wasserbehandlung diente als Negativkontrolle. Jeder Versuchsaufbau bestand aus einer sterilen Glasschale mit einem Fassungsvermögen von 500 ml und einer Dichte von 1 Kaulquappe pro 50 ml Lösung. Die Flasche war mit Polyethylenfolie abgedeckt, um Verdunstung zu verhindern, und wurde kontinuierlich belüftet.
Das Wasser wurde chemisch analysiert, um die Pestizidkonzentrationen nach 0, 96 und 168 Stunden zu bestimmen. Laut Sabin et al. 68 und Martins et al. 69 wurden die Analysen im Pesticide Analysis Laboratory (LARP) der Federal University of Santa Maria mittels Gaschromatographie gekoppelt mit Triple-Quadrupol-Massenspektrometrie (Varian Modell 1200, Palo Alto, Kalifornien, USA) durchgeführt. Die quantitative Bestimmung von Pestiziden im Wasser ist als ergänzendes Material aufgeführt (Tabelle SM1).
Für den Mikronukleustest (MNT) und den Erythrozyten-Kernanomalie-Test (RNA) wurden 15 Kaulquappen aus jeder Behandlungsgruppe analysiert. Die Kaulquappen wurden mit 5 % Lidocain (50 mg g-170) betäubt und Blutproben mittels Herzpunktion mit heparinisierten Einwegspritzen entnommen. Blutausstriche wurden auf sterilen Objektträgern präpariert, luftgetrocknet, 2 Minuten mit 100 % Methanol (4 °C) fixiert und anschließend 15 Minuten im Dunkeln mit 10 % Giemsa-Lösung gefärbt. Anschließend wurden die Objektträger mit destilliertem Wasser abgespült, um überschüssige Farbe zu entfernen, und bei Raumtemperatur getrocknet.
Mindestens 1000 rote Blutkörperchen von jeder Kaulquappe wurden mit einem 100×-Mikroskop mit einem 71-Objektiv analysiert, um das Vorhandensein von MN und ENA festzustellen. Insgesamt 75.796 rote Blutkörperchen von Kaulquappen wurden unter Berücksichtigung von Cypermethrin-Konzentrationen und Kontrollen ausgewertet. Die Genotoxizität wurde gemäß der Methode von Carrasco et al. und Fenech et al.38,72 analysiert, indem die Häufigkeit der folgenden Kernläsionen bestimmt wurde: (1) kernlose Zellen: Zellen ohne Kerne; (2) apoptotische Zellen: Kernfragmentierung, programmierter Zelltod; (3) zweikernige Zellen: Zellen mit zwei Kernen; (4) Kernknospen oder Bleb-Zellen: Zellen mit Kernen mit kleinen Ausstülpungen der Kernmembran, Blebs ähnlich der Größe von Mikrokernen; (5) karyolysierte Zellen: Zellen, die nur die Umrisse des Zellkerns ohne inneres Material aufweisen; (6) gekerbte Zellen: Zellen mit Kernen, die deutliche Risse oder Kerben in ihrer Form aufweisen (auch nierenförmige Kerne genannt); (7) gelappte Zellen: Zellen mit Kernvorsprüngen, die größer als die oben genannten Vesikel sind; und (8) Mikrozellen: Zellen mit verdichteten Kernen und reduziertem Zytoplasma. Die Veränderungen wurden mit den Ergebnissen der Negativkontrolle verglichen.
Die Ergebnisse des akuten Toxizitätstests (LC50) wurden mit der GBasic-Software und der TSK-getrimmten Spearman-Karber-Methode74 ausgewertet. Die chronischen Testdaten wurden vorab auf Fehlernormalität (Shapiro-Wilks) und Varianzhomogenität (Bartlett) geprüft. Die Ergebnisse wurden mittels einer univariaten Varianzanalyse (ANOVA) ausgewertet. Der Tukey-Test diente zum Vergleich der Daten untereinander, der Dunnett-Test zum Vergleich der Daten der Behandlungsgruppe mit der negativen Kontrollgruppe.
LOEC- und NOEC-Daten wurden mit dem Dunnett-Test analysiert. Die statistischen Tests erfolgten mit der Software Statistica 8.0 (StatSoft) mit einem Signifikanzniveau von 95 % (p < 0,05).
Veröffentlichungszeit: 13. März 2025