Diese Studie untersuchte die Letalität, Subletalität und Toxizität von kommerziellen Produkten.CypermethrinFormulierungen wurden an Froschkaulquappen getestet. Im akuten Test wurden Konzentrationen von 100–800 μg/L über 96 Stunden untersucht. Im chronischen Test wurden natürlich vorkommende Cypermethrin-Konzentrationen (1, 3, 6 und 20 μg/L) auf Mortalität, gefolgt von einem Mikronukleus-Test und der Untersuchung von Kernanomalien der roten Blutkörperchen über 7 Tage getestet. Die LC50 der kommerziellen Cypermethrin-Formulierung für Kaulquappen betrug 273,41 μg L−1. Im chronischen Test führte die höchste Konzentration (20 μg L−1) zu einer Mortalität von über 50 %, da sie die Hälfte der getesteten Kaulquappen tötete. Der Mikronukleus-Test zeigte signifikante Ergebnisse bei 6 und 20 μg L−1, und es wurden mehrere Kernanomalien festgestellt, was darauf hindeutet, dass die kommerzielle Cypermethrin-Formulierung ein genotoxisches Potenzial gegen P. gracilis aufweist. Cypermethrin stellt ein hohes Risiko für diese Art dar, da es kurz- und langfristig vielfältige Probleme verursachen und die Dynamik dieses Ökosystems beeinträchtigen kann. Daher lässt sich schlussfolgern, dass handelsübliche Cypermethrin-Präparate toxische Wirkungen auf P. gracilis haben.
Aufgrund der kontinuierlichen Ausweitung der landwirtschaftlichen Aktivitäten und der intensiven Anwendung vonSchädlingsbekämpfungTrotz dieser Maßnahmen sind Wassertiere häufig Pestiziden ausgesetzt1,2. Die Verschmutzung von Wasserressourcen in der Nähe von landwirtschaftlichen Flächen kann die Entwicklung und das Überleben von Nichtzielorganismen wie Amphibien beeinträchtigen.
Amphibien gewinnen zunehmend an Bedeutung bei der Bewertung von Umweltparametern. Froschlurche gelten aufgrund ihrer einzigartigen Merkmale wie komplexer Lebenszyklen, schnellem Larvenwachstum, trophischer Stellung, durchlässiger Haut10,11, Abhängigkeit von Wasser zur Fortpflanzung12 und ungeschützten Eiern11,13,14 als gute Bioindikatoren für Umweltverschmutzungen. Der Kleine Wasserfrosch (Physalaemus gracilis), auch bekannt als Trauerfrosch, hat sich als Bioindikator für Pestizidbelastung erwiesen4,5,6,7,15. Die Art kommt in stehenden Gewässern, Schutzgebieten und Gebieten mit variablem Lebensraum in Argentinien, Uruguay, Paraguay und Brasilien vor16,17 und wird aufgrund ihrer weiten Verbreitung und Toleranz gegenüber verschiedenen Lebensräumen von der IUCN als stabil eingestuft18.
Bei Amphibien wurden nach Exposition gegenüber Cypermethrin subletale Effekte beobachtet, darunter Verhaltens-, morphologische und biochemische Veränderungen bei Kaulquappen23,24,25, veränderte Mortalität und Metamorphosedauer, Enzymveränderungen, verringerter Schlüpferfolg24,25, Hyperaktivität26, Hemmung der Cholinesteraseaktivität27 sowie Veränderungen der Schwimmleistung7,28. Studien zu den genotoxischen Wirkungen von Cypermethrin bei Amphibien sind jedoch begrenzt. Daher ist es wichtig, die Empfindlichkeit von Froschlurchen gegenüber Cypermethrin zu untersuchen.
Umweltverschmutzung beeinträchtigt das normale Wachstum und die Entwicklung von Amphibien, wobei die schwerwiegendste Folge genetische Schäden an der DNA durch Pestizidbelastung sind13. Die Analyse der Blutzellmorphologie ist ein wichtiger Bioindikator für Umweltverschmutzung und die potenzielle Toxizität einer Substanz für Wildtiere29. Der Mikronukleustest ist eine der am häufigsten verwendeten Methoden zur Bestimmung der Genotoxizität von Chemikalien in der Umwelt30. Er ist eine schnelle, effektive und kostengünstige Methode, die sich gut als Indikator für die chemische Belastung von Organismen wie Amphibien eignet31,32 und Informationen über die Exposition gegenüber genotoxischen Schadstoffen liefern kann33.
Ziel dieser Studie war es, das toxische Potenzial von handelsüblichen Cypermethrin-Formulierungen gegenüber kleinen aquatischen Kaulquappen mittels eines Mikronukleustests und einer ökologischen Risikobewertung zu evaluieren.
Kumulative Mortalität (%) von P. gracilis-Kaulquappen, die während der akuten Testphase unterschiedlichen Konzentrationen von handelsüblichem Cypermethrin ausgesetzt waren.
Kumulative Mortalität (%) von P. gracilis-Kaulquappen, die während eines chronischen Tests unterschiedlichen Konzentrationen von handelsüblichem Cypermethrin ausgesetzt waren.
Die beobachtete hohe Mortalität war auf genotoxische Effekte bei Amphibien zurückzuführen, die unterschiedlichen Cypermethrin-Konzentrationen (6 und 20 μg/L) ausgesetzt waren. Dies zeigte sich durch das Auftreten von Mikrokernen (MN) und Kernanomalien in den Erythrozyten. Die Bildung von MN deutet auf Fehler in der Mitose hin und ist mit einer mangelhaften Bindung der Chromosomen an die Mikrotubuli, Defekten in Proteinkomplexen, die für die Aufnahme und den Transport der Chromosomen verantwortlich sind, Fehlern in der Chromosomensegregation und Fehlern in der DNA-Reparatur assoziiert38,39. Sie kann auch mit pestizidinduziertem oxidativem Stress zusammenhängen40,41. Weitere Anomalien wurden bei allen untersuchten Konzentrationen beobachtet. Steigende Cypermethrin-Konzentrationen erhöhten die Kernanomalien in den Erythrozyten um 5 % bei der niedrigsten (1 μg/L) und um 20 % bei der höchsten (20 μg/L) Dosis. Beispielsweise können Veränderungen der DNA einer Art schwerwiegende Folgen für das kurz- und langfristige Überleben haben und zu Populationsrückgängen, veränderter reproduktiver Fitness, Inzucht, Verlust der genetischen Vielfalt und veränderten Migrationsraten führen. All diese Faktoren können das Überleben und den Erhalt der Art beeinträchtigen42,43. Die Bildung von Erythrozytenanomalien kann auf eine Blockade der Zytokinese hinweisen, die zu abnormaler Zellteilung (zweikernige Erythrozyten) führt44,45; mehrlappige Kerne sind Ausstülpungen der Kernmembran mit mehreren Lappen46, während andere Erythrozytenanomalien mit DNA-Amplifikation, wie z. B. Kernnieren/Kernbläschen, assoziiert sein können47. Das Vorhandensein kernloser Erythrozyten kann auf einen beeinträchtigten Sauerstofftransport hinweisen, insbesondere in kontaminiertem Wasser48,49. Apoptose ist ein Zeichen für Zelltod50.
Weitere Studien haben ebenfalls die genotoxischen Wirkungen von Cypermethrin nachgewiesen. Kabaña et al.51 zeigten das Auftreten von Mikrokernen und Kernveränderungen wie zweikernigen und apoptotischen Zellen in Zellen von Odontophrynus americanus nach 96-stündiger Exposition gegenüber hohen Cypermethrin-Konzentrationen (5000 und 10.000 μg L−1). Cypermethrin-induzierte Apoptose wurde auch in P. biligonigerus52 und Rhinella arenarum53 beobachtet. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Cypermethrin genotoxische Wirkungen auf verschiedene Wasserorganismen hat und dass der MN- und ENA-Test ein Indikator für subletale Effekte auf Amphibien sein und auf einheimische Arten und Wildpopulationen, die Schadstoffen ausgesetzt sind, angewendet werden kann12.
Kommerzielle Cypermethrin-Formulierungen stellen ein hohes Umweltrisiko (akut und chronisch) dar, da die HQ-Werte den Grenzwert der US-Umweltschutzbehörde (EPA)54 überschreiten und die Arten bei Vorliegen in der Umwelt schädigen können. In der chronischen Risikobewertung lag der NOEC-Wert für Mortalität bei 3 μg L−1, was bestätigt, dass die im Wasser gefundenen Konzentrationen ein Risiko für die Arten darstellen können55. Der letale NOEC-Wert für R. arenarum-Larven, die einer Mischung aus Endosulfan und Cypermethrin ausgesetzt waren, betrug nach 168 Stunden 500 μg L−1; dieser Wert sank nach 336 Stunden auf 0,0005 μg L−1. Die Autoren zeigen, dass mit zunehmender Expositionsdauer die Konzentrationen, die für die Arten schädlich sind, sinken. Hervorzuheben ist außerdem, dass die NOEC-Werte höher waren als die von P. gracilis bei gleicher Expositionszeit, was darauf hindeutet, dass die Reaktion der Arten auf Cypermethrin artspezifisch ist. Hinsichtlich der Mortalität erreichte der CHQ-Wert von P. gracilis nach Exposition gegenüber Cypermethrin einen Wert von 64,67, der über dem von der US-Umweltschutzbehörde (EPA) festgelegten Referenzwert liegt⁵⁴. Auch der CHQ-Wert der Larven von R. arenarum war höher (CHQ > 388,00 nach 336 h), was darauf hindeutet, dass die untersuchten Insektizide ein hohes Risiko für verschiedene Amphibienarten darstellen. Da P. gracilis etwa 30 Tage für die Metamorphose benötigt⁵⁶, kann geschlossen werden, dass die untersuchten Cypermethrin-Konzentrationen zum Populationsrückgang beitragen können, indem sie infizierte Individuen daran hindern, frühzeitig das adulte oder reproduktive Stadium zu erreichen.
Bei der berechneten Risikobewertung von Mikrokernen und anderen nukleären Erythrozytenanomalien lagen die CHQ-Werte zwischen 14,92 und 97,00. Dies deutet darauf hin, dass Cypermethrin selbst in seinem natürlichen Lebensraum ein potenzielles genotoxisches Risiko für P. gracilis darstellt. Unter Berücksichtigung der Mortalität betrug die maximal tolerierbare Konzentration xenobiotischer Verbindungen für P. gracilis 4,24 μg/L. Allerdings zeigten bereits Konzentrationen von nur 1 μg/L genotoxische Wirkungen. Dies kann zu einer Zunahme der Anzahl abnormaler Individuen57 führen und die Entwicklung und Fortpflanzung der Art in ihrem Lebensraum beeinträchtigen, was wiederum einen Rückgang der Amphibienpopulationen zur Folge haben kann.
Kommerzielle Formulierungen des Insektizids Cypermethrin zeigten eine hohe akute und chronische Toxizität gegenüber P. gracilis. Es wurden erhöhte Mortalitätsraten beobachtet, die wahrscheinlich auf toxische Effekte zurückzuführen sind, wie das Vorhandensein von Mikrokernen und nukleären Anomalien der Erythrozyten, insbesondere gezackte, gelappte und vesikuläre Kerne, belegt. Darüber hinaus wiesen die untersuchten Arten erhöhte Umweltrisiken auf, sowohl akut als auch chronisch. Diese Daten, kombiniert mit früheren Studien unserer Forschungsgruppe, zeigten, dass selbst verschiedene kommerzielle Formulierungen von Cypermethrin eine verminderte Aktivität der Acetylcholinesterase (AChE) und Butyrylcholinesterase (BChE) sowie oxidativen Stress58 verursachten und zu Veränderungen der Schwimmaktivität und oralen Fehlbildungen59 bei P. gracilis führten. Dies deutet darauf hin, dass kommerzielle Formulierungen von Cypermethrin eine hohe letale und subletale Toxizität für diese Art aufweisen. (Hartmann et al.) Eine Studie ergab, dass kommerzielle Cypermethrin-Präparate im Vergleich zu neun anderen Pestiziden die höchste Toxizität für *P. gracilis* und eine weitere Art derselben Gattung (*P. cuvieri*) aufwiesen. Dies deutet darauf hin, dass die für den Umweltschutz zugelassenen Cypermethrin-Konzentrationen zu hoher Mortalität und einem langfristigen Populationsrückgang führen können.
Weitere Studien sind erforderlich, um die Toxizität des Pestizids für Amphibien zu beurteilen, da die in der Umwelt gefundenen Konzentrationen eine hohe Mortalität verursachen und ein potenzielles Risiko für P. gracilis darstellen können. Die Forschung an Amphibienarten sollte gefördert werden, da Daten zu diesen Organismen, insbesondere zu brasilianischen Arten, rar sind.
Der chronische Toxizitätstest dauerte 168 Stunden (7 Tage) unter statischen Bedingungen. Die subletalen Konzentrationen betrugen 1, 3, 6 und 20 μg Wirkstoff L⁻¹. In beiden Versuchen wurden jeweils 10 Kaulquappen pro Behandlungsgruppe in sechs Wiederholungen untersucht, insgesamt also 60 Kaulquappen pro Konzentration. Die Kontrollgruppe (nur Wasser) diente als Negativkontrolle. Jeder Versuchsaufbau bestand aus einer sterilen Glasschale mit einem Fassungsvermögen von 500 ml und einer Besatzdichte von 1 Kaulquappe pro 50 ml Lösung. Die Schale wurde mit Polyethylenfolie abgedeckt, um Verdunstung zu verhindern, und kontinuierlich belüftet.
Das Wasser wurde chemisch analysiert, um die Pestizidkonzentrationen nach 0, 96 und 168 Stunden zu bestimmen. Gemäß Sabin et al.68 und Martins et al.69 wurden die Analysen im Pestizidanalyselabor (LARP) der Bundesuniversität Santa Maria mittels Gaschromatographie gekoppelt mit Triple-Quadrupol-Massenspektrometrie (Varian Modell 1200, Palo Alto, Kalifornien, USA) durchgeführt. Die quantitative Bestimmung der Pestizide im Wasser ist in der ergänzenden Tabelle SM1 dargestellt.
Für den Mikronukleustest (MNT) und den Test auf Kernanomalien roter Blutkörperchen (RNA) wurden jeweils 15 Kaulquappen pro Behandlungsgruppe analysiert. Die Kaulquappen wurden mit 5%igem Lidocain (50 mg/g) anästhesiert, und die Blutentnahme erfolgte mittels Herzpunktion mit heparinisierten Einwegspritzen. Blutausstriche wurden auf sterilen Objektträgern angefertigt, luftgetrocknet, 2 Minuten lang mit 100%igem Methanol (4 °C) fixiert und anschließend 15 Minuten lang im Dunkeln mit 10%iger Giemsa-Lösung gefärbt. Abschließend wurden die Objektträger mit destilliertem Wasser gewaschen, um überschüssige Farbe zu entfernen, und bei Raumtemperatur getrocknet.
Mindestens 1000 Erythrozyten jeder Kaulquappe wurden mit einem 100-fachen Mikroskop und einem 71-fachen Objektiv auf das Vorhandensein von Mikrokernen (MN) und extranukleären Adhäsionen (ENA) untersucht. Insgesamt wurden 75.796 Erythrozyten von Kaulquappen unter Berücksichtigung verschiedener Cypermethrin-Konzentrationen und Kontrollen ausgewertet. Die Genotoxizität wurde nach der Methode von Carrasco et al. und Fenech et al.38,72 analysiert, indem die Häufigkeit der folgenden Kernläsionen bestimmt wurde: (1) kernlose Zellen: Zellen ohne Zellkern; (2) apoptotische Zellen: Kernfragmentierung, programmierter Zelltod; (3) zweikernige Zellen: Zellen mit zwei Zellkernen; (4) Zellen mit Kernknospen oder Kernbläschen: Zellen mit Zellkernen, die kleine Ausstülpungen der Kernmembran aufweisen, ähnlich den Mikrokernen; (5) karyolysierte Zellen: Zellen, bei denen nur noch die Kontur des Zellkerns ohne Zellkernmaterial erkennbar ist. (6) gekerbte Zellen: Zellen mit Zellkernen, die deutliche Risse oder Kerben aufweisen, auch nierenförmige Zellkerne genannt; (7) gelappte Zellen: Zellen mit Kernausstülpungen, die größer als die zuvor genannten Vesikel sind; und (8) Mikrozellen: Zellen mit kondensierten Zellkernen und reduziertem Zytoplasma. Die Veränderungen wurden mit den Ergebnissen der Negativkontrolle verglichen.
Die Ergebnisse des akuten Toxizitätstests (LC50) wurden mit der GBasic-Software und der TSK-getrimmten Spearman-Karber-Methode74 analysiert. Die Daten des chronischen Tests wurden vorab auf Normalverteilung (Shapiro-Wilk-Test) und Varianzhomogenität (Bartlett-Test) geprüft. Die Ergebnisse wurden mittels einfaktorieller Varianzanalyse (ANOVA) analysiert. Der Tukey-Test wurde zum Vergleich der Daten untereinander und der Dunnett-Test zum Vergleich der Daten zwischen der Behandlungsgruppe und der Negativkontrollgruppe verwendet.
Die LOEC- und NOEC-Daten wurden mittels Dunnett-Test analysiert. Die statistischen Tests wurden mit der Software Statistica 8.0 (StatSoft) bei einem Signifikanzniveau von 95 % (p < 0,05) durchgeführt.
Veröffentlichungsdatum: 13. März 2025