Phosphorylierung aktiviert den zentralen Wachstumsregulator DELLA in Arabidopsis, indem sie die Assoziation von Histon H2A mit Chromatin fördert.

DELLA-Proteine ​​sind konservierte MasterproteineWachstumsregulatorenDELLA spielt eine zentrale Rolle bei der Steuerung der Pflanzenentwicklung als Reaktion auf interne und externe Signale. Es fungiert als Transkriptionsregulator und wird durch Bindung an Transkriptionsfaktoren (TFs) und Histon H2A über seine GRAS-Domäne an Zielpromotoren rekrutiert. Jüngste Studien haben gezeigt, dass die Stabilität von DELLA posttranslational durch zwei Mechanismen reguliert wird: Polyubiquitinierung durch das Phytohormon Gibberellin, die zu seinem schnellen Abbau führt, und Konjugation kleiner Ubiquitin-ähnlicher Modifikatoren (SUMO), die seine Akkumulation erhöht. Darüber hinaus wird die Aktivität von DELLA dynamisch durch zwei verschiedene Glykosylierungen reguliert: Die DELLA-TF-Interaktion wird durch O-Fucosylierung verstärkt, aber durch O-verknüpfte N-Acetylglucosamin-Modifikation (O-GlcNAc) gehemmt. Die Rolle der DELLA-Phosphorylierung ist jedoch weiterhin unklar, da frühere Studien widersprüchliche Ergebnisse lieferten. Diese reichen von Studien, die zeigen, dass die Phosphorylierung den DELLA-Abbau fördert oder verringert, bis hin zu solchen, die keinen Einfluss auf seine Stabilität feststellen. Hier identifizieren wir Phosphorylierungsstellen im REPRESSORga1-3(RGA, AtDELLA) wurden mittels Massenspektrometrie aus Arabidopsis thaliana isoliert. Die Phosphorylierung zweier RGA-Peptide an den PolyS- und PolyS/T-Regionen fördert die H2A-Bindung und erhöht die RGA-Aktivität. RGA assoziiert mit Zielpromotoren. Bemerkenswerterweise beeinflusst die Phosphorylierung weder die RGA-TF-Interaktionen noch die Stabilität von RGA. Unsere Studie klärt den molekularen Mechanismus auf, durch den die Phosphorylierung die DELLA-Aktivität induziert.
Um die Rolle der Phosphorylierung bei der Regulation der DELLA-Funktion aufzuklären, ist es entscheidend, DELLA-Phosphorylierungsstellen in vivo zu identifizieren und funktionelle Analysen in Pflanzen durchzuführen. Mittels Affinitätsreinigung von Pflanzenextrakten und anschließender MS/MS-Analyse identifizierten wir mehrere Phosphorylierungsstellen in RGA. Unter GA-Mangelbedingungen steigt die RHA-Phosphorylierung an, beeinflusst jedoch nicht deren Stabilität. Wichtig ist, dass Co-IP- und ChIP-qPCR-Assays zeigten, dass die Phosphorylierung an der PolyS/T-Region von RGA dessen Interaktion mit H2A und die Bindung an Zielpromotoren fördert. Dies enthüllt den Mechanismus, durch den die Phosphorylierung die RGA-Funktion induziert.
RGA wird durch die Interaktion der LHR1-Subdomäne mit TF an das Zielchromatin rekrutiert und bindet anschließend über seine PolyS/T-Region und PFYRE-Subdomäne an H2A. Dadurch bildet sich der H2A-RGA-TF-Komplex, der RGA stabilisiert. Die Phosphorylierung von Pep 2 in der PolyS/T-Region zwischen der DELLA-Domäne und der GRAS-Domäne durch eine unbekannte Kinase verstärkt die RGA-H2A-Bindung. Das mutierte Protein rgam2A verhindert die RGA-Phosphorylierung und nimmt eine veränderte Proteinkonformation an, wodurch die H2A-Bindung gestört wird. Dies führt zur Destabilisierung transienter TF-rgam2A-Interaktionen und zur Dissoziation von rgam2A vom Zielchromatin. Die Abbildung zeigt ausschließlich die RGA-vermittelte Transkriptionsrepression. Ein ähnliches Muster ließe sich auch für die RGA-vermittelte Transkriptionsaktivierung beschreiben, mit dem Unterschied, dass der H2A-RGA-TF-Komplex die Transkription von Zielgenen fördern und die Dephosphorylierung von rgam2A die Transkription verringern würde. Abbildung modifiziert nach Huang et al.21.
Alle quantitativen Daten wurden mit Excel statistisch analysiert, und signifikante Unterschiede wurden mittels t-Test nach Student ermittelt. Die Stichprobengröße wurde nicht vorab statistisch bestimmt. Es wurden keine Daten von der Analyse ausgeschlossen; das Experiment war nicht randomisiert; die Forschenden waren während des Experiments und der Auswertung der Ergebnisse über die Datenverteilung informiert. Die Stichprobengröße ist in der Abbildungslegende und der Quelldatei angegeben.
Weitere Informationen zum Studiendesign finden Sie im Abstract des Natural Portfolio Report, das diesem Artikel beigefügt ist.
Die Massenspektrometrie-Proteomikdaten wurden über das Partner-Repository PRIDE66 mit der Datensatzkennung PXD046004 an das ProteomeXchange-Konsortium übermittelt. Alle weiteren in dieser Studie erhobenen Daten sind in den Zusatzinformationen, den ergänzenden Datendateien und den Rohdatendateien enthalten. Die Quelldaten sind für diesen Artikel verfügbar.