DELLA-Proteine sind konserviertWachstumsregulatorenDELLAs spielen eine zentrale Rolle in der Pflanzenentwicklung als Reaktion auf interne und externe Signale. Als Transkriptionsregulatoren binden sie über ihre GRAS-Domänen an Transkriptionsfaktoren (TFs) und Histon H2A und werden rekrutiert, um an Promotoren zu wirken. Jüngste Studien haben gezeigt, dass die Stabilität von DELLAs posttranslational durch zwei Mechanismen reguliert wird: Polyubiquitinierung, induziert durch das Pflanzenhormon DELLA.GibberellinDies führt zu ihrem raschen Abbau und zur Konjugation mit dem kleinen Ubiquitin-ähnlichen Modifikator (SUMO), was ihre Akkumulation erhöht. Darüber hinaus wird die DELLA-Aktivität dynamisch durch zwei unterschiedliche Glykosylierungsmechanismen reguliert: O-Fucosylierung verstärkt die DELLA-TF-Interaktion, während die O-verknüpfte N-Acetylglucosamin-Modifikation (O-GlcNAc) diese hemmt. Die Rolle der DELLA-Phosphorylierung ist jedoch unklar, da frühere Studien widersprüchliche Ergebnisse lieferten. Einige Studien deuten darauf hin, dass die Phosphorylierung den DELLA-Abbau fördert oder hemmt, andere wiederum, dass sie keinen Einfluss auf die Stabilität hat. In dieser Studie identifizieren wir Phosphorylierungsstellen im GA1-3-Repressor (RGA) AtDELLA, der aus Arabidopsis thaliana mittels Massenspektrometrie gereinigt wurde, und zeigen, dass die Phosphorylierung zweier RGA-Peptide in den PolyS- und PolyS/T-Regionen die RGA-Aktivität durch Förderung der H2A-Bindung und der Assoziation von RGA mit Zielpromotoren erhöht. Bemerkenswerterweise hatte die Phosphorylierung keinen Einfluss auf die RGA-TF-Interaktionen oder die RGA-Stabilität. Unsere Studie enthüllt einen molekularen Mechanismus, durch den die Phosphorylierung die DELLA-Aktivität induziert.
Unsere massenspektrometrische Analyse zeigte, dass sowohl Pep1 als auch Pep2 in RGA im GA-defizienten Ga1-Hintergrund stark phosphoryliert waren. Zusätzlich zu dieser Studie wiesen phosphoproteomische Untersuchungen ebenfalls eine Phosphorylierung von Pep1 in RGA nach, obwohl deren Funktion noch nicht untersucht wurde53,54,55. Im Gegensatz dazu wurde die Phosphorylierung von Pep2 bisher nicht beschrieben, da dieses Peptid nur mithilfe des RGAGKG-Transgens nachgewiesen werden konnte. Obwohl die m1A-Mutation, die die Phosphorylierung von Pep1 aufhob, die RGA-Aktivität in der Pflanze nur geringfügig reduzierte, verstärkte sie diese Wirkung in Kombination mit m2A (Ergänzende Abbildung 6). Bemerkenswerterweise war die Phosphorylierung von Pep1 in der GA-verstärkten sly1-Mutante im Vergleich zu ga1 signifikant reduziert, was darauf hindeutet, dass GA die Dephosphorylierung von RGA fördert und dadurch dessen Aktivität verringert. Der Mechanismus, durch den GA die RGA-Phosphorylierung hemmt, bedarf weiterer Untersuchungen. Eine Möglichkeit besteht darin, dass dies durch die Regulation einer unbekannten Proteinkinase erreicht wird. Obwohl Studien gezeigt haben, dass die Expression der CK1-Proteinkinase EL1 in Reis durch GA herunterreguliert wird41, deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass Mutationen höherer Ordnung des Arabidopsis-EL1-Homologs (AEL1-4) die RGA-Phosphorylierung nicht verringern. In Übereinstimmung mit unseren Ergebnissen konnte eine kürzlich durchgeführte Phosphoproteomstudie mit Arabidopsis-AEL-überexprimierenden Linien und einer ael-Dreifachmutante keine DELLA-Proteine als Substrate dieser Kinasen identifizieren56. Zum Zeitpunkt der Manuskripterstellung wurde berichtet, dass GSK3, das Gen, das eine GSK3/SHAGGY-ähnliche Kinase in Weizen (Triticum aestivum) kodiert, DELLA (Rht-B1b) phosphorylieren kann57, obwohl die Phosphorylierung von Rht-B1b durch GSK3 in der Pflanze noch nicht bestätigt wurde. In-vitro-Enzymreaktionen in Gegenwart von GSK3, gefolgt von massenspektrometrischer Analyse, identifizierten drei Phosphorylierungsstellen zwischen den DELLA- und GRAS-Domänen von Rht-B1b (Ergänzende Abb. 3). Serin-zu-Alanin-Substitutionen an allen drei Phosphorylierungsstellen führten zu einer verminderten Rht-B1b-Aktivität in transgenem Weizen, was mit unseren Befunden übereinstimmt, dass Alanin-Substitutionen in Pep2 RGA die RGA-Aktivität verringern. In-vitro-Proteinabbau-Assays zeigten jedoch weiterhin, dass Phosphorylierung auch Rht-B1b57 stabilisieren kann. Dies steht im Widerspruch zu unseren Ergebnissen, die zeigen, dass Alanin-Substitutionen in Pep2 RGA dessen Stabilität in der Pflanze nicht beeinflussen. GSK3 in Weizen ist ein Ortholog des Brassinosteroid-unempfindlichen Proteins 2 (BIN2) in Arabidopsis 57. BIN2 ist ein negativer Regulator der BR-Signalübertragung, und BR aktiviert diesen Signalweg durch den Abbau von BIN2 58. Wir konnten zeigen, dass die BR-Behandlung weder die Stabilität von RGA 59 noch den Phosphorylierungsgrad in Arabidopsis verringert (Ergänzende Abbildung 2), was darauf hindeutet, dass RGA wahrscheinlich nicht durch BIN2 phosphoryliert wird.
Alle quantitativen Daten wurden mit Excel statistisch analysiert, und signifikante Unterschiede wurden mittels t-Test nach Student ermittelt. Die Stichprobengröße wurde nicht im Voraus statistisch bestimmt. Es wurden keine Daten von der Analyse ausgeschlossen; das Experiment war nicht randomisiert; und die Forschenden kannten die Gruppenzuordnung während des Experiments und der Ergebnisauswertung. Die Stichprobengrößen sind in den Abbildungslegenden und in den Rohdatendateien angegeben.
Veröffentlichungsdatum: 15. April 2025