DELLA-Proteine sind konserviertWachstumsregulatorenDELLAs spielen eine zentrale Rolle in der Pflanzenentwicklung als Reaktion auf interne und externe Signale. Als Transkriptionsregulatoren binden DELLAs über ihre GRAS-Domänen an Transkriptionsfaktoren (TFs) und Histon H2A und werden rekrutiert, um auf Promotoren einzuwirken. Neuere Studien haben gezeigt, dass die DELLA-Stabilität posttranslational durch zwei Mechanismen reguliert wird: Polyubiquitinierung, induziert durch das PflanzenhormonGibberellin, was zu ihrem schnellen Abbau führt, und Konjugation mit einem kleinen ubiquitinähnlichen Modifikator (SUMO), der ihre Akkumulation erhöht. Außerdem wird die DELLA-Aktivität dynamisch durch zwei verschiedene Glykosylierungsmechanismen reguliert: O-Fucosylierung verstärkt die DELLA-TF-Interaktion, während O-gebundene N-Acetylglucosamin (O-GlcNAc)-Modifikation die DELLA-TF-Interaktion hemmt. Die Rolle der DELLA-Phosphorylierung ist jedoch unklar, da vorherige Studien widersprüchliche Ergebnisse zeigten. Einige legen nahe, dass Phosphorylierung den DELLA-Abbau fördert oder unterdrückt, während andere vermuten, dass Phosphorylierung keine Auswirkungen auf die Stabilität hat. Hier identifizieren wir Phosphorylierungsstellen im GA1-3-Repressor (RGA), AtDELLA, der durch Massenspektrometrie aus Arabidopsis thaliana isoliert wurde, und zeigen, dass die Phosphorylierung von zwei RGA-Peptiden in den PolyS- und PolyS/T-Regionen die RGA-Aktivität erhöht, indem sie die H2A-Bindung und RGA-Assoziation mit Zielpromotoren fördert. Bemerkenswerterweise hatte die Phosphorylierung keinen Einfluss auf die RGA-TF-Interaktionen oder die RGA-Stabilität. Unsere Studie enthüllt einen molekularen Mechanismus, durch den die Phosphorylierung die DELLA-Aktivität induziert.
Unsere massenspektrometrische Analyse ergab, dass sowohl Pep1 als auch Pep2 in RGA im GA-defizienten Ga1-Hintergrund stark phosphoryliert waren. Zusätzlich zu dieser Studie haben auch phosphoproteomische Studien eine Pep1-Phosphorylierung in RGA gezeigt, obwohl ihre Rolle noch nicht untersucht wurde53,54,55. Im Gegensatz dazu wurde die Pep2-Phosphorylierung bisher nicht beschrieben, da dieses Peptid nur mit dem RGAGKG-Transgen nachgewiesen werden konnte. Obwohl die m1A-Mutation, die die Pep1-Phosphorylierung aufhob, die RGA-Aktivität in planta nur leicht verringerte, hatte sie in Kombination mit m2A einen additiven Effekt bei der Verringerung der RGA-Aktivität (Ergänzende Abbildung 6). Wichtig ist, dass die Pep1-Phosphorylierung im GA-verstärkten sly1-Mutanten im Vergleich zu ga1 signifikant reduziert war, was nahelegt, dass GA die RGA-Dephosphorylierung fördert und dessen Aktivität verringert. Der Mechanismus, durch den GA die RGA-Phosphorylierung unterdrückt, muss noch weiter untersucht werden. Eine Möglichkeit ist, dass dies durch die Regulierung einer nicht identifizierten Proteinkinase erreicht wird. Obwohl Studien gezeigt haben, dass die Expression der CK1-Proteinkinase EL1 in Reis durch GA herunterreguliert wird41, deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass höherstufige Mutationen des Arabidopsis-EL1-Homologs (AEL1-4) die RGA-Phosphorylierung nicht verringern. In Übereinstimmung mit unseren Ergebnissen konnte in einer kürzlich durchgeführten phosphoproteomischen Studie mit AEL-überexprimierenden Arabidopsis-Linien und einem ael-Dreifachmutanten keine DELLA-Proteine als Substrate dieser Kinasen identifiziert56. Als wir das Manuskript erstellten, wurde berichtet, dass GSK3, das Gen, das für eine GSK3/SHAGGY-ähnliche Kinase in Weizen (Triticum aestivum) kodiert, DELLA (Rht-B1b) phosphorylieren kann57, obwohl die Phosphorylierung von Rht-B1b durch GSK3 in Pflanzen nicht bestätigt wurde. In-vitro-Enzymreaktionen in Gegenwart von GSK3, gefolgt von einer massenspektrometrischen Analyse, zeigten drei Phosphorylierungsstellen zwischen den DELLA- und GRAS-Domänen von Rht-B1b (Ergänzende Abbildung 3). Serin-zu-Alanin-Substitutionen an allen drei Phosphorylierungsstellen führten zu einer verringerten Rht-B1b-Aktivität in transgenem Weizen, was mit unseren Befunden übereinstimmt, dass Alaninsubstitutionen in Pep2 RGA die RGA-Aktivität verringerten. In-vitro-Proteinabbau-Tests zeigten jedoch zusätzlich, dass Phosphorylierung auch Rht-B1b57 stabilisieren kann. Dies steht im Widerspruch zu unseren Ergebnissen, die zeigen, dass Alaninsubstitutionen in Pep2 RGA dessen Stabilität in planta nicht verändern. GSK3 in Weizen ist ein Ortholog des Brassinosteroid-unempfindlichen Proteins 2 (BIN2) in Arabidopsis 57. BIN2 ist ein negativer Regulator der BR-Signalgebung und BR aktiviert seinen Signalweg, indem es den Abbau von BIN2 verursacht 58. Wir haben gezeigt, dass die BR-Behandlung weder die RGA-Stabilität 59 noch die Phosphorylierungsgrade in Arabidopsis verringert (Ergänzende Abbildung 2), was darauf hindeutet, dass RGA wahrscheinlich nicht durch BIN2 phosphoryliert wird.
Alle quantitativen Daten wurden mit Excel statistisch ausgewertet, und signifikante Unterschiede wurden mit dem Student-t-Test ermittelt. Es wurden keine statistischen Methoden zur Vorabbestimmung der Stichprobengröße verwendet. Es wurden keine Daten von der Analyse ausgeschlossen; das Experiment war nicht randomisiert; die Forscher waren sich der Verteilung während des Experiments und der Ergebnisbewertung bewusst. Die Stichprobengrößen sind in den Bildlegenden und in den Rohdatendateien angegeben.
Veröffentlichungszeit: 15. April 2025