Das Wachstum des Sprossapikalmeristems (SAM) ist entscheidend für die Stammarchitektur. PflanzenhormoneGibberelline(GAs) spielen eine Schlüsselrolle bei der Koordinierung des Pflanzenwachstums, aber ihre Rolle im SAM ist noch immer wenig verstanden. Hier haben wir einen ratiometrischen Biosensor für GA-Signale entwickelt, indem wir das DELLA-Protein so verändert haben, dass seine wesentliche regulatorische Funktion in der GA-Transkriptionsantwort unterdrückt wird, während sein Abbau bei GA-Erkennung erhalten bleibt. Wir zeigen, dass dieser auf Abbau basierende Biosensor Änderungen der GA-Werte und der zellulären Wahrnehmung während der Entwicklung genau aufzeichnet. Wir haben diesen Biosensor verwendet, um die GA-Signalaktivität im SAM abzubilden. Wir zeigen, dass hohe GA-Signale vorwiegend in Zellen zwischen Organanlagen vorhanden sind, die Vorläufer der Internodien sind. Unter Verwendung von Gain- und Loss-of-Function-Ansätzen zeigen wir außerdem, dass GA die Ausrichtung der Zellteilungsebene reguliert, die kanonische zelluläre Organisation der Internodien festlegt und dadurch die Internodienspezifizierung im SAM fördert.
Das Sprossapikalmeristem (SAM) an der Sprossspitze enthält eine Nische aus Stammzellen, deren Aktivität während des gesamten Lebens der Pflanze modular und iterativ Seitenorgane und Sprossknoten erzeugt. Jede dieser sich wiederholenden Einheiten oder Pflanzenknoten umfasst Internodien und Seitenorgane an den Knoten sowie Achselmeristeme in den Blattachseln1. Wachstum und Organisation der Pflanzenknoten verändern sich während der Entwicklung. Bei Arabidopsis wird das Internodienwachstum während der vegetativen Phase unterdrückt, und die Achselmeristeme verbleiben inaktiv in den Achseln der Rosettenblätter. Während des Übergangs zur Blütenphase wird das SAM zum Blütenmeristem und erzeugt verlängerte Internodien und Achselknospen, Zweige in den Achseln der Stängelblätter und später blattlose Blüten2. Obwohl wir beim Verständnis der Mechanismen, die die Entstehung von Blättern, Blüten und Zweigen steuern, erhebliche Fortschritte gemacht haben, ist relativ wenig darüber bekannt, wie Internodien entstehen.
Das Verständnis der räumlich-zeitlichen Verteilung von GAs wird dazu beitragen, die Funktionen dieser Hormone in verschiedenen Geweben und in verschiedenen Entwicklungsstadien besser zu verstehen. Die Visualisierung des Abbaus der RGA-GFP-Fusion, die unter der Wirkung ihres eigenen Promotors exprimiert wird, liefert wichtige Informationen zur Regulierung des Gesamt-GA-Spiegels in Wurzeln15,16. Die RGA-Expression variiert jedoch zwischen Geweben17 und wird durch GA18 reguliert. Daher kann die unterschiedliche Expression des RGA-Promotors zu dem mit RGA-GFP beobachteten Fluoreszenzmuster führen, weshalb diese Methode nicht quantitativ ist. Kürzlich zeigte mit bioaktivem Fluorescein (Fl) markiertes GA19,20 die Ansammlung von GA im Wurzelendokortex und die Regulierung seines zellulären Spiegels durch GA-Transport. Kürzlich zeigte der GA-FRET-Sensor nlsGPS1, dass GA-Spiegel mit der Zellverlängerung in Wurzeln, Filamenten und im Dunkeln gewachsenen Hypokotylen korrelieren21. Wie wir jedoch gesehen haben, ist die GA-Konzentration nicht der einzige Parameter, der die GA-Signalaktivität steuert, da sie von komplexen Erfassungsprozessen abhängt. Aufbauend auf unserem Verständnis der DELLA- und GA-Signalwege berichten wir hier über die Entwicklung und Charakterisierung eines auf Degradation basierenden ratiometrischen Biosensors für die GA-Signalgebung. Zur Entwicklung dieses quantitativen Biosensors verwendeten wir ein mutiertes GA-sensitives RGA, das mit einem fluoreszierenden Protein fusioniert und ubiquitär in Geweben exprimiert wurde, sowie ein GA-unsensitives fluoreszierendes Protein. Wir zeigen, dass die mutierten RGA-Proteinfusionen bei ubiquitärer Expression die endogene GA-Signalgebung nicht stören und dass dieser Biosensor die Signalaktivität, die sowohl aus der GA-Eingabe als auch aus der GA-Signalverarbeitung durch den Sensorapparat resultiert, mit hoher räumlich-zeitlicher Auflösung quantifizieren kann. Wir verwendeten diesen Biosensor, um die räumlich-zeitliche Verteilung der GA-Signalaktivität abzubilden und zu quantifizieren, wie GA das Zellverhalten in der SAM-Epidermis reguliert. Wir zeigen, dass GA die Ausrichtung der Teilungsebene von SAM-Zellen zwischen Organanlagen reguliert und so die kanonische Zellorganisation des Internodiums definiert.
Schließlich fragten wir uns, ob qmRGA Veränderungen der endogenen GA-Werte anhand wachsender Hypokotyle erfassen könnte. Wir haben zuvor gezeigt, dass Nitrat das Wachstum durch eine erhöhte GA-Synthese und damit den Abbau von DELLA34 stimuliert. Dementsprechend beobachteten wir, dass die Hypokotyllänge bei pUBQ10::qmRGA-Sämlingen, die unter reichlicher Nitratzufuhr (10 mM NO3−) gewachsen sind, signifikant länger war als bei Sämlingen, die unter nitratarmen Bedingungen gewachsen sind (Ergänzende Abb. 6a). In Übereinstimmung mit der Wachstumsreaktion waren die GA-Signale in den Hypokotylen von Sämlingen, die unter 10 mM NO3−-Bedingungen gewachsen sind, höher als in Sämlingen, die ohne Nitrat gewachsen sind (Ergänzende Abb. 6b, c). Somit ermöglicht qmRGA auch die Überwachung von Veränderungen der GA-Signalgebung, die durch endogene Veränderungen der GA-Konzentration hervorgerufen werden.
Um zu verstehen, ob die von qmRGA erkannte GA-Signalaktivität von der GA-Konzentration und der GA-Wahrnehmung abhängt, wie aufgrund des Sensordesigns zu erwarten, analysierten wir die Expression der drei GID1-Rezeptoren in vegetativem und reproduktivem Gewebe. In Sämlingen zeigte die GID1-GUS-Reporterlinie, dass GID1a und c in Keimblättern stark exprimiert wurden (Abb. 3a–c). Darüber hinaus wurden alle drei Rezeptoren in Blättern, seitlichen Wurzelanlagen, Wurzelspitzen (mit Ausnahme der Wurzelkappe von GID1b) und dem Gefäßsystem exprimiert (Abb. 3a–c). Im SAM des Blütenstands erkannten wir GUS-Signale nur für GID1b und 1c (Ergänzende Abb. 7a–c). In-situ-Hybridisierung bestätigte diese Expressionsmuster und zeigte weiterhin, dass GID1c im SAM gleichmäßig in geringen Mengen exprimiert wurde, während GID1b an der Peripherie des SAM eine höhere Expression zeigte (Ergänzende Abb. 7d–l). Die translationale Fusion von pGID1b::2xmTQ2-GID1b ergab auch eine abgestufte Bandbreite der GID1b-Expression, von geringer oder keiner Expression im Zentrum des SAM bis zu hoher Expression an den Organgrenzen (Ergänzende Abb. 7m). Daher sind die GID1-Rezeptoren nicht gleichmäßig über und innerhalb der Gewebe verteilt. In nachfolgenden Experimenten beobachteten wir auch, dass die Überexpression von GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) die Empfindlichkeit von qmRGA in Hypokotylen gegenüber externer GA-Applikation erhöhte (Abb. 3d, e). Im Gegensatz dazu war die mit qd17mRGA im Hypokotyl gemessene Fluoreszenz unempfindlich gegenüber der GA3-Behandlung (Abb. 3f, g). Für beide Tests wurden die Setzlinge mit hohen GA-Konzentrationen (100 μM GA3) behandelt, um das schnelle Verhalten des Sensors zu beurteilen, wobei die Fähigkeit zur Bindung an den GID1-Rezeptor verstärkt wurde oder verloren ging. Zusammen bestätigen diese Ergebnisse, dass der qmRGA-Biosensor eine kombinierte Funktion als GA- und GA-Sensor erfüllt, und legen nahe, dass die unterschiedliche Expression des GID1-Rezeptors die Emissivität des Sensors signifikant modulieren kann.
Bis heute ist die Verteilung der GA-Signale in der SAM unklar. Daher verwendeten wir qmRGA-exprimierende Pflanzen und den Stammzellreporter pCLV3::mCherry-NLS35, um hochauflösende quantitative Karten der GA-Signalaktivität zu berechnen, wobei wir uns auf die L1-Schicht (Epidermis; Abb. 4a, b, siehe Methoden und ergänzende Methoden) konzentrierten, da L1 eine Schlüsselrolle bei der Kontrolle des SAM-Wachstums spielt36. Hier lieferte die Expression von pCLV3::mCherry-NLS einen festen geometrischen Referenzpunkt für die Analyse der räumlich-zeitlichen Verteilung der GA-Signalaktivität37. Obwohl GA als essentiell für die Entwicklung seitlicher Organe gilt4, beobachteten wir, dass die GA-Signale im Blütenprimordium (P) ab dem Stadium P3 niedrig waren (Abb. 4a, b), während junge P1- und P2-Primordien eine moderate Aktivität ähnlich der in der zentralen Region aufwiesen (Abb. 4a, b). Eine höhere GA-Signalaktivität wurde an den Grenzen der Organanlagen festgestellt, beginnend bei P1/P2 (an den Seiten der Grenze) und mit einem Maximum bei P4, sowie in allen Zellen der peripheren Region zwischen den Anlagen (Abb. 4a, b und ergänzende Abb. 8a, b). Diese höhere GA-Signalaktivität wurde nicht nur in der Epidermis, sondern auch in den Schichten L2 und L3 beobachtet (ergänzende Abb. 8b). Das Muster der im SAM mittels qmRGA erkannten GA-Signale blieb im Zeitverlauf ebenfalls unverändert (ergänzende Abb. 8c–f, k). Obwohl das qd17mRGA-Konstrukt im SAM von T3-Pflanzen aus fünf unabhängigen Linien, die wir detailliert charakterisiert haben, systematisch herunterreguliert war, konnten wir die mit dem pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP-Konstrukt erhaltenen Fluoreszenzmuster analysieren (ergänzende Abb. 8g–j, l). In dieser Kontrolllinie wurden nur geringfügige Änderungen des Fluoreszenzverhältnisses im SAM festgestellt, aber im SAM-Zentrum beobachteten wir eine deutliche und unerwartete Abnahme von VENUS, die mit TagBFP assoziiert ist. Dies bestätigt, dass das von qmRGA beobachtete Signalmuster einen GA-abhängigen Abbau von mRGA-VENUS widerspiegelt, zeigt aber auch, dass qmRGA die GA-Signalaktivität im Meristemzentrum überschätzen könnte. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse ein GA-Signalmuster, das in erster Linie die Verteilung der Primordien widerspiegelt. Diese Verteilung der interprimordialen Region (IPR) ist auf die allmähliche Etablierung einer hohen GA-Signalaktivität zwischen dem sich entwickelnden Primordium und der zentralen Region zurückzuführen, während gleichzeitig die GA-Signalaktivität im Primordium abnimmt (Abb. 4c, d).
Die Verteilung der GID1b- und GID1c-Rezeptoren (siehe oben) deutet darauf hin, dass die unterschiedliche Expression von GA-Rezeptoren das Muster der GA-Signalaktivität im SAM mitgestaltet. Wir fragten uns, ob eine unterschiedliche Ansammlung von GA daran beteiligt sein könnte. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, verwendeten wir den nlsGPS1-GA-FRET-Sensor21. Eine erhöhte Aktivierungsfrequenz wurde im SAM von nlsGPS1 festgestellt, das 100 Minuten lang mit 10 μM GA4+7 behandelt wurde (Ergänzende Abb. 9a–e), was darauf hindeutet, dass nlsGPS1 auf Änderungen der GA-Konzentration im SAM reagiert, wie es dies auch in Wurzeln tut21. Die räumliche Verteilung der nlsGPS1-Aktivierungsfrequenz enthüllte relativ niedrige GA-Werte in den äußeren Schichten des SAM, zeigte jedoch, dass sie in der Mitte und an den Rändern des SAM erhöht waren (Abb. 4e und Ergänzende Abb. 9a,c). Dies deutet darauf hin, dass GA auch im SAM mit einem räumlichen Muster verteilt ist, das mit dem von qmRGA aufgedeckten vergleichbar ist. Als ergänzenden Ansatz behandelten wir das SAM auch mit fluoreszierendem GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) oder Fl allein als Negativkontrolle. Das Fl-Signal war im gesamten SAM verteilt, einschließlich der zentralen Region und des Primordiums, wenn auch mit geringerer Intensität (Abb. 4j und ergänzende Abb. 10d). Im Gegensatz dazu sammelten sich alle drei GA-Fl spezifisch innerhalb der Primordium-Grenzen und in unterschiedlichem Ausmaß im Rest des IPR an, wobei sich GA7-Fl im größten Bereich des IPR anreicherte (Abb. 4k und ergänzende Abb. 10a,b). Die Quantifizierung der Fluoreszenzintensität ergab, dass das Verhältnis von IPR- zu Nicht-IPR-Intensität in mit GA-Fl behandeltem SAM höher war als in mit Fl behandeltem SAM (Abb. 4l und ergänzende Abb. 10c). Zusammengenommen weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass GA in höheren Konzentrationen in IPR-Zellen vorhanden ist, die sich am nächsten zum Organrand befinden. Dies deutet darauf hin, dass das Muster der SAM-GA-Signalaktivität sowohl aus der unterschiedlichen Expression von GA-Rezeptoren als auch aus der unterschiedlichen Ansammlung von GA in IPR-Zellen in der Nähe von Organgrenzen resultiert. Somit ergab unsere Analyse ein unerwartetes räumlich-zeitliches Muster der GA-Signalisierung mit geringerer Aktivität im Zentrum und Primordium des SAM und höherer Aktivität im IPR in der peripheren Region.
Um die Rolle der differentiellen GA-Signalaktivität im SAM zu verstehen, analysierten wir die Korrelation zwischen GA-Signalaktivität, Zellexpansion und Zellteilung mithilfe von Echtzeit-Zeitrafferbildern des SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Angesichts der Rolle von GA bei der Wachstumsregulation wurde eine positive Korrelation mit den Zellexpansionparametern erwartet. Daher verglichen wir zunächst Karten der GA-Signalaktivität mit Karten der Zelloberflächenwachstumsrate (als Proxy für die Stärke der Zellexpansion für eine gegebene Zelle und für Tochterzellen bei der Teilung) und mit Karten der Wachstumsanisotropie, die die Richtung der Zellexpansion misst (wird hier auch für eine gegebene Zelle und für Tochterzellen bei der Teilung verwendet; Abb. 5a,b, siehe Methoden und ergänzende Methoden). Unsere Karten der SAM-Zelloberflächenwachstumsrate stimmen mit früheren Beobachtungen überein38,39, mit minimalen Wachstumsraten am Rand und maximalen Wachstumsraten in sich entwickelnden Blüten (Abb. 5a). Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) zeigte, dass die GA-Signalaktivität negativ mit der Zelloberflächenwachstumsintensität korreliert (Abbildung 5c). Wir zeigten außerdem, dass die Hauptvariationsachsen, einschließlich GA-Signaleingang und Wachstumsintensität, orthogonal zur durch die hohe CLV3-Expression bestimmten Richtung verliefen, was den Ausschluss von Zellen aus dem SAM-Zentrum in den verbleibenden Analysen bestätigte. Die Spearman-Korrelationsanalyse bestätigte die PCA-Ergebnisse (Abbildung 5d) und deutete darauf hin, dass höhere GA-Signale im IPR nicht zu einer stärkeren Zellexpansion führten. Die Korrelationsanalyse ergab jedoch eine leichte positive Korrelation zwischen GA-Signalaktivität und Wachstumsanisotropie (Abbildung 5c, d), was darauf hindeutet, dass eine höhere GA-Signalisierung im IPR die Richtung des Zellwachstums und möglicherweise die Position der Zellteilungsebene beeinflusst.
a, b Heatmaps des mittleren Oberflächenwachstums (a) und der Wachstumsanisotropie (b) in SAM, gemittelt über sieben unabhängige Pflanzen (verwendet als Stellvertreter für die Stärke bzw. Richtung der Zellexpansion). c Die PCA-Analyse umfasste die folgenden Variablen: GA-Signal, Oberflächenwachstumsintensität, Oberflächenwachstumsanisotropie und CLV3-Expression. PCA-Komponente 1 korrelierte hauptsächlich negativ mit der Oberflächenwachstumsintensität und positiv mit dem GA-Signal. PCA-Komponente 2 korrelierte hauptsächlich positiv mit der Oberflächenwachstumsanisotropie und negativ mit der CLV3-Expression. Die Prozentangaben stellen die durch die einzelnen Komponenten erklärte Variation dar. d Spearman-Korrelationsanalyse zwischen GA-Signal, Oberflächenwachstumsintensität und Oberflächenwachstumsanisotropie auf Gewebeebene ohne CZ. Die Zahl rechts ist der Spearman-Rho-Wert zwischen zwei Variablen. Sternchen zeigen Fälle an, in denen die Korrelation/negative Korrelation hochsignifikant ist. e 3D-Visualisierung von Col-0 SAM L1-Zellen durch konfokale Mikroskopie Nach 10 Stunden werden im SAM (aber nicht im Primordium) neue Zellwände entsprechend ihren Winkelwerten eingefärbt. Der Farbbalken wird in der unteren rechten Ecke angezeigt. Das Einschubbild zeigt das entsprechende 3D-Bild bei 0 Stunden. Das Experiment wurde zweimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. f Boxplots zeigen die Zellteilungsraten in IPR- und Nicht-IPR-Col-0-SAM (n = 10 unabhängige Pflanzen). Die Mittellinie zeigt den Median und die Boxgrenzen zeigen das 25. und 75. Perzentil an. Whisker zeigen die mit der Software R bestimmten Minimal- und Maximalwerte an. P-Werte wurden mit dem zweiseitigen t-Test von Welch erhalten. g, h Schematische Darstellung, die (g) zeigt, wie der Winkel der neuen Zellwand (magenta) in Bezug auf die radiale Richtung vom Zentrum des SAM (weiße gepunktete Linie) gemessen wird (nur spitze Winkelwerte, d. h. 0–90°, werden berücksichtigt), und (h) die zirkumferenziellen/lateralen und radialen Richtungen innerhalb des Meristems. i Häufigkeitshistogramme der Zellteilungsebenenorientierung über SAM (dunkelblau), IPR (mittelblau) und Nicht-IPR (hellblau). P-Werte wurden durch einen zweiseitigen Kolmogorov-Smirnov-Test ermittelt. Das Experiment wurde zweimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. j Häufigkeitshistogramme der Zellteilungsebenenorientierung des IPR um P3 (hellgrün), P4 (mittelgrün) und P5 (dunkelgrün). P-Werte wurden durch einen zweiseitigen Kolmogorov-Smirnov-Test ermittelt. Das Experiment wurde zweimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.
Daher untersuchten wir als nächstes den Zusammenhang zwischen GA-Signalisierung und Zellteilungsaktivität, indem wir während des Tests neu gebildete Zellwände identifizierten (Abb. 5e). Dieser Ansatz ermöglichte es uns, die Häufigkeit und Richtung der Zellteilung zu messen. Überraschenderweise stellten wir fest, dass die Häufigkeit der Zellteilungen im IPR und im Rest des SAM (nicht-IPR, Abb. 5f) ähnlich war. Dies deutet darauf hin, dass Unterschiede in der GA-Signalisierung zwischen IPR- und Nicht-IPR-Zellen die Zellteilung nicht signifikant beeinflussen. Dies und die positive Korrelation zwischen GA-Signalisierung und Wachstumsanisotropie veranlassten uns zu der Überlegung, ob die GA-Signalaktivität die Ausrichtung der Zellteilungsebene beeinflussen könnte. Wir haben die Ausrichtung der neuen Zellwand als spitzen Winkel zur radialen Achse gemessen, die das Meristemzentrum mit dem Zentrum der neuen Zellwand verbindet (Abb. 5e-i) und eine klare Tendenz der Zellen zur Zellteilung in Winkeln nahe 90° zur radialen Achse beobachtet, wobei die höchsten Frequenzen bei 70–80° (23,28 %) und 80–90° (22,62 %) beobachtet wurden (Abb. 5e,i), was Zellteilungen in Umfangs-/Querrichtung entspricht (Abb. 5h). Um den Beitrag der GA-Signalgebung zu diesem Zellteilungsverhalten zu untersuchen, haben wir die Zellteilungsparameter im IPR und Nicht-IPR separat analysiert (Abb. 5i). Wir beobachteten, dass sich die Teilungswinkelverteilung in IPR-Zellen von der in Nicht-IPR-Zellen oder in Zellen des gesamten SAM unterschied, wobei IPR-Zellen einen höheren Anteil lateraler/zirkulärer Zellteilungen aufwiesen, d. h. 70–80° und 80–90° (entsprechende Anteile: 33,86 % bzw. 30,71 %) (Abb. 5i). Unsere Beobachtungen enthüllten somit einen Zusammenhang zwischen hoher GA-Signalisierung und einer Ausrichtung der Zellteilungsebene nahe der Kreisrichtung, ähnlich der Korrelation zwischen GA-Signalaktivität und Wachstumsanisotropie (Abb. 5c, d). Um die räumliche Erhaltung dieses Zusammenhangs weiter zu untermauern, maßen wir die Ausrichtung der Teilungsebene in IPR-Zellen rund um das Primordium ab P3, da in dieser Region ab P4 die höchste GA-Signalaktivität festgestellt wurde (Abb. 4). Die Teilungswinkel der IPR um P3 und P4 zeigten keine statistisch signifikanten Unterschiede, obwohl in den IPR um P4 eine erhöhte Häufigkeit lateraler Zellteilungen beobachtet wurde (Abb. 5j). In den IPR-Zellen um P5 herum wurde der Unterschied in der Ausrichtung der Zellteilungsebene jedoch statistisch signifikant, mit einem starken Anstieg der Häufigkeit transversaler Zellteilungen (Abb. 5j). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass GA-Signalisierung die Ausrichtung der Zellteilungen im SAM steuern kann, was mit früheren Berichten40,41 übereinstimmt, wonach eine hohe GA-Signalisierung eine laterale Ausrichtung der Zellteilungen im IPR induzieren kann.
Es wird erwartet, dass Zellen im IPR nicht in Primordien, sondern in Internodien integriert werden2,42,43. Die transversale Ausrichtung der Zellteilungen im IPR könnte zu der typischen Anordnung paralleler Längsreihen epidermaler Zellen in Internodien führen. Unsere oben beschriebenen Beobachtungen legen nahe, dass die GA-Signalgebung in diesem Prozess wahrscheinlich eine Rolle spielt, indem sie die Richtung der Zellteilung reguliert.
Der Funktionsverlust mehrerer DELLA-Gene führt zu einer konstitutiven GA-Reaktion, und della-Mutanten können zum Testen dieser Hypothese verwendet werden44. Wir analysierten zunächst die Expressionsmuster von fünf DELLA-Genen im SAM. Die Transkriptionelle Fusion der GUS-Linie45 ergab, dass GAI, RGA, RGL1 und RGL2 (in viel geringerem Maße) im SAM exprimiert wurden (Ergänzende Abb. 11a–d). In-situ-Hybridisierung zeigte außerdem, dass sich GAI-mRNA spezifisch in Primordien und sich entwickelnden Blüten ansammelt (Ergänzende Abb. 11e). RGL1- und RGL3-mRNA wurden im gesamten SAM-Kronendach und in älteren Blüten nachgewiesen, während RGL2-mRNA im Randbereich häufiger vorkam (Ergänzende Abb. 11f–h). Die konfokale Abbildung von pRGL3::RGL3-GFP SAM bestätigte die durch In-situ-Hybridisierung beobachtete Expression und zeigte, dass sich das RGL3-Protein im zentralen Teil des SAM anreichert (Ergänzende Abb. 11i). Mithilfe der pRGA::GFP-RGA-Linie fanden wir auch heraus, dass sich das RGA-Protein im SAM anreichert, seine Häufigkeit jedoch an der Grenze ab P4 abnimmt (Ergänzende Abb. 11j). Bemerkenswerterweise stimmen die Expressionsmuster von RGL3 und RGA mit einer höheren GA-Signalaktivität im IPR überein, wie durch qmRGA festgestellt (Abb. 4). Darüber hinaus deuten diese Daten darauf hin, dass alle DELLAs im SAM exprimiert werden und dass sich ihre Expression kollektiv über das gesamte SAM erstreckt.
Als nächstes analysierten wir die Zellteilungsparameter im Wildtyp-SAM (Ler, Kontrolle) und den gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della-Fünffach-(globalen)-Mutanten (Abb. 6a, b). Interessanterweise beobachteten wir eine statistisch signifikante Verschiebung in der Verteilung der Zellteilungswinkelhäufigkeiten im della-globalen Mutanten-SAM im Vergleich zum Wildtyp (Abb. 6c). Diese Veränderung im della-globalen Mutanten war auf eine Zunahme der Häufigkeit von 80–90°-Winkeln (34,71 % vs. 24,55 %) und, in geringerem Maße, von 70–80°-Winkeln (23,78 % vs. 20,18 %) zurückzuführen, d. h. entsprechend transversalen Zellteilungen (Abb. 6c). Die Häufigkeit nicht-transversaler Teilungen (0–60°) war im della-globalen Mutanten ebenfalls niedriger (Abb. 6c). Die Häufigkeit transversaler Zellteilungen war im SAM des globalen della-Mutanten signifikant erhöht (Abb. 6b). Die Häufigkeit transversaler Zellteilungen im IPR war im globalen della-Mutanten im Vergleich zum Wildtyp ebenfalls höher (Abb. 6d). Außerhalb der IPR-Region hatte der Wildtyp eine gleichmäßigere Verteilung der Zellteilungswinkel, während der globale della-Mutant wie der IPR tangentiale Teilungen bevorzugte (Abb. 6e). Wir haben auch die Ausrichtung der Zellteilungen im SAM von ga2-Oxidase (ga2ox)-Fünffachmutanten (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 und ga2ox6-2) quantifiziert, einem GA-inaktiven Mutantenhintergrund, in dem sich GA ansammelt. In Übereinstimmung mit dem Anstieg der GA-Werte war das SAM des fünffachen ga2ox-Mutantenblütenstands größer als das von Col-0 (Ergänzende Abb. 12a, b), und im Vergleich zu Col-0 zeigte das fünffache ga2ox-SAM eine deutlich andere Verteilung der Zellteilungswinkel, wobei die Winkelhäufigkeit von 50° auf 90° anstieg, d. h. wieder tangentiale Teilungen begünstigten (Ergänzende Abb. 12a–c). Somit zeigen wir, dass die konstitutive Aktivierung der GA-Signalgebung und die GA-Akkumulation laterale Zellteilungen im IPR und dem Rest des SAM induzieren.
a, b 3D-Visualisierung der L1-Schicht von PI-gefärbtem Ler (a) und globalem della-Mutanten (b) SAM mittels Konfokalmikroskopie. Neue Zellwände, die sich im SAM über einen Zeitraum von 10 Stunden gebildet haben (aber nicht das Primordium), werden angezeigt und entsprechend ihren Winkelwerten eingefärbt. Das Einschubbild zeigt das SAM bei 0 Stunden. Der Farbbalken wird in der unteren rechten Ecke angezeigt. Der Pfeil in (b) zeigt auf ein Beispiel ausgerichteter Zelldateien im globalen della-Mutanten. Das Experiment wurde zweimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. ce Vergleich der Häufigkeitsverteilung der Ausrichtungen der Zellteilungsebenen im gesamten SAM (d), IPR (e) und Nicht-IPR (f) zwischen Ler und globalem della. P-Werte wurden mittels eines zweiseitigen Kolmogorov-Smirnov-Tests erhalten. f, g 3D-Visualisierung von Konfokalbildern von PI-gefärbtem SAM von Col-0 (i) und pCUC2::gai-1-VENUS (j) transgenen Pflanzen. Die Abbildungen (a, b) zeigen die Bildung neuer Zellwände (aber keine Primordien) im SAM innerhalb von 10 Stunden. Das Experiment wurde zweimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. h–j Vergleich der Häufigkeitsverteilung der Zellteilungsebenenorientierungen im gesamten SAM (h), IPR (i) und Nicht-IPR (j) zwischen Col-0- und pCUC2::gai-1-VENUS-Pflanzen. P-Werte wurden mit einem zweiseitigen Kolmogorov-Smirnov-Test ermittelt.
Als nächstes testeten wir die Wirkung der Hemmung der GA-Signalgebung speziell im IPR. Zu diesem Zweck nutzten wir den Cotyledon Cup 2 (CUC2)-Promotor, um die Expression eines dominant negativen gai-1-Proteins anzutreiben, das mit VENUS fusioniert ist (in der Linie pCUC2::gai-1-VENUS). Im Wildtyp-SAM treibt der CUC2-Promotor die Expression der meisten IPRs im SAM an, einschließlich der Randzellen, ab P4, und eine ähnliche spezifische Expression wurde in pCUC2::gai-1-VENUS-Pflanzen beobachtet (siehe unten). Die Verteilung der Zellteilungswinkel über das SAM oder IPR von pCUC2::gai-1-VENUS-Pflanzen unterschied sich nicht signifikant von der des Wildtyps, obwohl wir unerwarteterweise feststellten, dass sich Zellen ohne IPR in diesen Pflanzen mit einer höheren Frequenz von 80–90° teilten (Abb. 6f–j).
Es wurde vermutet, dass die Richtung der Zellteilung von der Geometrie des SAM abhängt, insbesondere von der durch die Gewebekrümmung erzeugten Zugspannung46. Wir haben uns daher gefragt, ob die Form des SAM im della-Globalmutanten und in den pCUC2::gai-1-VENUS-Pflanzen verändert ist. Wie bereits zuvor berichtet12, war das SAM des della-Globalmutanten größer als das des Wildtyps (Ergänzende Abb. 13a, b, d). In-situ-Hybridisierung von CLV3- und STM-RNA bestätigte die Meristemexpansion bei della-Mutanten und zeigte außerdem die laterale Expansion der Stammzellnische (Ergänzende Abb. 13e, f, h, i). Die SAM-Krümmung war jedoch bei beiden Genotypen ähnlich (Ergänzende Abb. 13k, m, n, p). Wir beobachteten eine ähnliche Größenzunahme beim gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della-Vierfachmutanten ohne eine Änderung der Krümmung im Vergleich zum Wildtyp (Ergänzende Abb. 13c, d, g, j, l, o, p). Die Häufigkeit der Zellteilungsorientierung war beim della-Vierfachmutanten ebenfalls beeinflusst, jedoch in geringerem Maße als beim monolithischen della-Mutanten (Ergänzende Abb. 12d–f). Dieser Dosierungseffekt sowie das Fehlen einer Auswirkung auf die Krümmung weisen darauf hin, dass die verbleibende RGL3-Aktivität beim Della-Vierfachmutanten Änderungen der Zellteilungsorientierung aufgrund des Verlusts der DELLA-Aktivität begrenzt und dass Änderungen der lateralen Zellteilungen eher als Reaktion auf Änderungen der GA-Signalaktivität als auf Änderungen der SAM-Geometrie auftreten. Wie oben beschrieben, treibt der CUC2-Promoter die IPR-Expression im SAM beginnend bei P4 an (Ergänzende Abb. 14a, b), und im Gegensatz dazu hatte das pCUC2::gai-1-VENUS SAM eine geringere Größe, aber eine stärkere Krümmung (Ergänzende Abb. 14c–h). Diese Veränderung der Morphologie des pCUC2::gai-1-VENUS SAM kann zu einer anderen Verteilung mechanischer Spannungen im Vergleich zum Wildtyp führen, bei dem hohe zirkumferenzielle Spannungen in einer kürzeren Entfernung vom SAM-Zentrum beginnen47. Alternativ können die Veränderungen der Morphologie des pCUC2::gai-1-VENUS SAM das Ergebnis von Veränderungen regionaler mechanischer Eigenschaften sein, die durch die Expression des Transgens induziert werden48. In beiden Fällen könnte dies die Auswirkungen der Veränderungen der GA-Signalgebung teilweise ausgleichen, indem es die Wahrscheinlichkeit erhöht, dass sich Zellen in zirkumferenzieller/transversaler Ausrichtung teilen, was unsere Beobachtungen erklärt.
Zusammenfassend bestätigen unsere Daten, dass eine höhere GA-Signalisierung eine aktive Rolle bei der lateralen Ausrichtung der Zellteilungsebene im IPR spielt. Sie zeigen auch, dass die Meristemkrümmung ebenfalls die Ausrichtung der Zellteilungsebene im IPR beeinflusst.
Die transversale Ausrichtung der Teilungsebene im IPR aufgrund der hohen GA-Signalaktivität deutet darauf hin, dass GA eine radiale Zellreihe in der Epidermis innerhalb des SAM vororganisiert, um die Zellorganisation zu definieren, die später im epidermalen Internodium zu finden sein wird. Tatsächlich waren solche Zellreihen häufig in SAM-Bildern von della-globalen Mutanten sichtbar (Abb. 6b). Um die entwicklungsbedingte Funktion des räumlichen Musters der GA-Signalisierung im SAM weiter zu erforschen, verwendeten wir Zeitrafferaufnahmen, um die räumliche Organisation von Zellen im IPR in Wildtyp- (Ler und Col-0), della-globalen Mutanten und pCUC2::gai-1-VENUS-transgenen Pflanzen zu analysieren.
Wir fanden heraus, dass qmRGA zeigte, dass die GA-Signalaktivität im IPR ab P1/P2 zunahm und bei P4 ihren Höhepunkt erreichte, und dass dieses Muster im Zeitverlauf konstant blieb (Abb. 4a–f und ergänzende Abb. 8c–f, k). Um die räumliche Organisation der Zellen im IPR mit zunehmendem GA-Signal zu analysieren, markierten wir Ler-IPR-Zellen oberhalb und seitlich von P4 entsprechend ihrem entwicklungsbezogenen Schicksal, das 34 Stunden nach der ersten Beobachtung analysiert wurde, d. h. mehr als zwei Plastidenzeiten, wodurch wir die IPR-Zellen während der Primordiumentwicklung von P1/P2 bis P4 verfolgen konnten. Wir verwendeten drei verschiedene Farben: Gelb für jene Zellen, die in das Primordium nahe P4 integriert wurden, Grün für jene, die sich im IPR befanden, und Violett für jene, die an beiden Prozessen beteiligt waren (Abb. 7a–c). Bei t0 (0 h) waren 1–2 Schichten von IPR-Zellen vor P4 sichtbar (Abb. 7a). Wie erwartet teilten sich diese Zellen hauptsächlich entlang der transversalen Teilungsebene (Abb. 7a–c). Ähnliche Ergebnisse wurden mit Col-0 SAM erzielt (mit Fokus auf P3, dessen Rand sich ähnlich wie P4 bei Ler faltet), obwohl bei diesem Genotyp die am Blütenrand gebildete Falte die IPR-Zellen schneller verbarg (Abb. 7g–i). Das Teilungsmuster der IPR-Zellen ordnet die Zellen also vorab in radialen Reihen an, wie in Internodien. Die Organisation der radialen Reihen und die Lokalisierung der IPR-Zellen zwischen aufeinanderfolgenden Organen legen nahe, dass es sich bei diesen Zellen um internodale Vorläuferzellen handelt.
Hier haben wir einen ratiometrischen GA-Signalbiosensor namens qmRGA entwickelt, der eine quantitative Kartierung der GA-Signalaktivität ermöglicht, die sich aus kombinierten GA- und GA-Rezeptorkonzentrationen ergibt, während er gleichzeitig die Interferenz mit endogenen Signalwegen minimiert und so Informationen über die GA-Funktion auf zellulärer Ebene liefert. Zu diesem Zweck haben wir ein modifiziertes DELLA-Protein namens mRGA konstruiert, das die Fähigkeit verloren hat, DELLA-Interaktionspartner zu binden, aber weiterhin empfindlich auf GA-induzierte Proteolyse reagiert. qmRGA reagiert sowohl auf exogene als auch endogene Änderungen des GA-Spiegels, und seine dynamischen Sensoreigenschaften ermöglichen die Bewertung räumlich-zeitlicher Änderungen der GA-Signalaktivität während der Entwicklung. qmRGA ist zudem ein sehr flexibles Werkzeug, da es durch Änderung des für seine Expression verwendeten Promotors (falls erforderlich) an unterschiedliche Gewebe angepasst werden kann, und angesichts der konservierten Natur des GA-Signalwegs und des PFYRE-Motivs bei Angiospermen ist es wahrscheinlich auf andere Arten übertragbar22. In Übereinstimmung damit wurde ebenfalls gezeigt, dass eine äquivalente Mutation im Reis-SLR1-DELLA-Protein (HYY497AAA) die wachstumshemmende Aktivität von SLR1 unterdrückt, während sie seinen GA-vermittelten Abbau nur geringfügig verringert, ähnlich wie mRGA23. Bemerkenswerterweise haben neuere Studien an Arabidopsis gezeigt, dass eine einzelne Aminosäuremutation in der PFYRE-Domäne (S474L) die Transkriptionsaktivität von RGA verändert, ohne seine Fähigkeit zur Interaktion mit Transkriptionsfaktorpartnern zu beeinträchtigen50. Obwohl diese Mutation den 3 in mRGA vorhandenen Aminosäuresubstitutionen sehr ähnlich ist, zeigen unsere Studien, dass diese beiden Mutationen unterschiedliche Eigenschaften von DELLA verändern. Obwohl die meisten Transkriptionsfaktorpartner an die LHR1- und SAW-Domänen von DELLA26,51 binden, können einige konservierte Aminosäuren in der PFYRE-Domäne dabei helfen, diese Interaktionen zu stabilisieren.
Die Internodienentwicklung ist ein Schlüsselmerkmal der Pflanzenarchitektur und Ertragssteigerung. qmRGA ergab eine höhere GA-Signalaktivität in IPR-Internodien-Vorläuferzellen. Durch die Kombination von quantitativer Bildgebung und Genetik zeigten wir, dass GA-Signalmuster kreisförmige/transversale Zellteilungsebenen in der SAM-Epidermis überlagern und so die für die Internodienentwicklung erforderliche Zellteilungsorganisation formen. Während der Entwicklung wurden mehrere Regulatoren der Ausrichtung der Zellteilungsebene identifiziert52,53. Unsere Arbeit liefert ein klares Beispiel dafür, wie die GA-Signalaktivität diesen zellulären Parameter reguliert. DELLA kann mit Präfaltungsproteinkomplexen interagieren41, sodass die GA-Signalaktivität die Ausrichtung der Zellteilungsebene möglicherweise durch direkte Beeinflussung der Ausrichtung kortikaler Mikrotubuli regulieren könnte40,41,54,55. Wir zeigten unerwarteterweise, dass in SAM das Korrelat einer höheren GA-Signalaktivität nicht Zellverlängerung oder -teilung war, sondern nur Wachstumsanisotropie, was mit einer direkten Wirkung von GA auf die Richtung der Zellteilung im IPR übereinstimmt. Wir können jedoch nicht ausschließen, dass dieser Effekt auch indirekt sein könnte, beispielsweise vermittelt durch eine GA-induzierte Zellwanderweichung56. Änderungen der Zellwandeigenschaften induzieren mechanischen Stress57,58, der auch die Orientierung der Zellteilungsebene beeinflussen kann, indem er die Orientierung kortikaler Mikrotubuli beeinflusst39,46,59. Die kombinierten Effekte von GA-induziertem mechanischem Stress und direkter Regulierung der Mikrotubuli-Orientierung durch GA könnten an der Entstehung eines spezifischen Musters der Zellteilungsorientierung im IPR beteiligt sein, um Internodien zu definieren, und es sind weitere Studien nötig, um diese Idee zu überprüfen. Ebenso haben frühere Studien die Bedeutung der mit DELLA interagierenden Proteine TCP14 und 15 bei der Kontrolle der Internodienbildung hervorgehoben60,61 und diese Faktoren könnten zusammen mit BREVIPEDICELLUS (BP) und PENNYWISE (PNY) die Wirkung von GA vermitteln, die die Internodienentwicklung regulieren und nachweislich die GA-Signalgebung beeinflussen2,62. Angesichts der Tatsache, dass DELLAs mit Signalwegen von Brassinosteroiden, Ethylen, Jasmonsäure und Abscisinsäure (ABA) interagieren63,64 und dass diese Hormone die Ausrichtung der Mikrotubuli beeinflussen können65, können die Auswirkungen von GA auf die Ausrichtung der Zellteilung auch durch andere Hormone vermittelt werden.
Frühe zytologische Studien zeigten, dass sowohl die inneren als auch die äußeren Bereiche des SAM von Arabidopsis für die Internodienentwicklung erforderlich sind2,42. Die Tatsache, dass GA die Zellteilung im inneren Gewebe aktiv reguliert12, stützt eine Doppelfunktion von GA bei der Regulierung der Meristem- und Internodiengröße im SAM. Auch das Muster der gerichteten Zellteilung ist im inneren SAM-Gewebe streng reguliert, und diese Regulierung ist für das Stammwachstum essentiell52. Es wird interessant sein zu untersuchen, ob GA auch eine Rolle bei der Ausrichtung der Zellteilungsebene im inneren SAM-Gewebe spielt und dadurch die Spezifizierung und Entwicklung der Internodien innerhalb des SAM synchronisiert.
Die Pflanzen wurden in vitro in Erde oder 1x Murashige-Skoog (MS)-Medium (Duchefa), ergänzt mit 1 % Saccharose und 1 % Agar (Sigma), unter Standardbedingungen (16 h Licht, 22 °C) gezüchtet, mit Ausnahme der Hypokotyl- und Wurzelwachstumsexperimente, bei denen die Sämlinge auf vertikalen Platten unter konstantem Licht und 22 °C gezüchtet wurden. Für Nitratexperimente wurden die Pflanzen auf modifiziertem MS-Medium (bioWORLD-Pflanzenmedium), ergänzt mit ausreichend Nitrat (0 oder 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-Succinat, 1 % Saccharose und 1 % A-Agar (Sigma), unter Langtagbedingungen gezüchtet.
In pDONR221 eingefügte GID1a-cDNA wurde mit pDONR P4-P1R-pUBQ10 und pDONR P2R-P3-mCherry in pB7m34GW rekombiniert, um pUBQ10::GID1a-mCherry zu erzeugen. In pDONR221 eingefügte IDD2-DNA wurde in pB7RWG266 rekombiniert, um p35S:IDD2-RFP zu erzeugen. Um pGID1b::2xmTQ2-GID1b zu erzeugen, wurden zunächst ein 3,9 kb großes Fragment vor der GID1b-Codierungsregion und ein 4,7 kb großes Fragment, das die GID1b-cDNA (1,3 kb) und den Terminator (3,4 kb) enthielt, mit den Primern in der Ergänzungstabelle 3 amplifiziert und dann in pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) bzw. pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) eingefügt und schließlich mit pDONR221 2xmTQ268 unter Verwendung der Gateway-Klonierung in den Zielvektor pGreen 012567 rekombiniert. Zur Erzeugung von pCUC2::LSSmOrange wurde die CUC2-Promotersequenz (3229 bp stromaufwärts von ATG), gefolgt von der codierenden Sequenz des großen Stokes-verschobenen mOrange (LSSmOrange)69 mit dem N7-Kernlokalisierungssignal und dem NOS-Transkriptionsterminator mithilfe des Gateway-3-Fragment-Rekombinationssystems (Invitrogen) in den Kanamycin-Zielvektor pGreen eingebaut. Der pflanzliche Binärvektor wurde in den Agrobacterium tumefaciens-Stamm GV3101 eingeführt und mittels der Agrobacterium-Infiltrationsmethode in Blätter von Nicotiana benthamiana bzw. mittels der Floral-Dip-Methode in Arabidopsis thaliana Col-0 eingebracht. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry und pCLV3::mCherry-NLS qmRGA wurden aus den F3- bzw. F1-Nachkommen der jeweiligen Kreuzungen isoliert.
Die RNA-in-situ-Hybridisierung wurde an ca. 1 cm langen Sprossspitzen72 durchgeführt. Diese wurden gesammelt und sofort in einer auf 4 °C vorgekühlten FAA-Lösung (3,7 % Formaldehyd, 5 % Essigsäure, 50 % Ethanol) fixiert. Nach zwei × 15-minütigen Vakuumbehandlungen wurde das Fixativ gewechselt und die Proben über Nacht inkubiert. GID1a-, GID1b-, GID1c-, GAI-, RGL1-, RGL2- und RGL3-cDNAs und Antisense-Sonden für ihre 3′-UTRs wurden mit den in der Ergänzungstabelle 3 gezeigten Primern synthetisiert, wie von Rosier et al.73 beschrieben. Digoxigenin-markierte Sonden wurden mithilfe von Digoxigenin-Antikörpern (3000-fache Verdünnung; Roche, Katalognummer: 11 093 274 910) immundetektiert und die Schnitte mit einer 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat-Lösung (BCIP, 250-fache Verdünnung)/Nitroblautetrazolium-Lösung (NBT, 200-fache Verdünnung) gefärbt.
Veröffentlichungszeit: 10. Februar 2025