Quantitativer Gibberellin-Biosensor enthüllt die Rolle der Gibberelline bei der Internodienspezifizierung im Sprossapikalmeristem

Das Wachstum des Sprossapikalmeristems (SAM) ist entscheidend für die Stammarchitektur. PflanzenhormoneGibberellineGibberelline (GAs) spielen eine Schlüsselrolle bei der Koordination des Pflanzenwachstums, ihre Funktion im Sprossapikalmeristem (SAM) ist jedoch noch weitgehend unerforscht. Wir haben einen ratiometrischen Biosensor für GA-Signalisierung entwickelt, indem wir das DELLA-Protein so verändert haben, dass seine essentielle regulatorische Funktion in der GA-Transkriptionsantwort unterdrückt wird, während sein Abbau nach GA-Erkennung erhalten bleibt. Wir zeigen, dass dieser auf Abbau basierende Biosensor Veränderungen des GA-Spiegels und der zellulären Wahrnehmung während der Entwicklung präzise erfasst. Mithilfe dieses Biosensors kartierten wir die GA-Signalaktivität im SAM. Wir konnten zeigen, dass hohe GA-Signale vorwiegend in Zellen zwischen den Organanlagen, den Vorläuferzellen der Internodien, auftreten. Mithilfe von Gain- und Loss-of-Function-Experimenten demonstrierten wir weiterhin, dass GA die Orientierung der Zellteilungsebene reguliert, die kanonische zelluläre Organisation der Internodien festlegt und somit die Internodienspezifizierung im SAM fördert.
Das Sprossapikalmeristem (SAM) an der Sprossspitze enthält eine Nische von Stammzellen, deren Aktivität während des gesamten Pflanzenlebens modular und iterativ Seitenorgane und Sprossknoten bildet. Jede dieser sich wiederholenden Einheiten, die Pflanzenknoten, umfasst Internodien und Seitenorgane sowie Achselmeristeme in den Blattachseln¹. Wachstum und Organisation der Pflanzenknoten verändern sich während der Entwicklung. Bei Arabidopsis ist das Internodienwachstum im vegetativen Stadium unterdrückt, und die Achselmeristeme bleiben in den Blattachseln der Rosettenblätter inaktiv. Beim Übergang zur Blütenphase wandelt sich das SAM in das Blütenstandsmeristem um und bildet verlängerte Internodien und Achselknospen, Zweige in den Blattachseln der Stängelblätter und später blattlose Blüten². Obwohl wir bedeutende Fortschritte im Verständnis der Mechanismen erzielt haben, die die Bildung von Blättern, Blüten und Zweigen steuern, ist relativ wenig darüber bekannt, wie Internodien entstehen.
Das Verständnis der räumlich-zeitlichen Verteilung von Gibberellinen (GA) trägt zu einem besseren Verständnis ihrer Funktionen in verschiedenen Geweben und Entwicklungsstadien bei. Die Visualisierung des Abbaus von RGA-GFP-Fusionsproteinen, die unter der Kontrolle ihres eigenen Promotors exprimiert werden, liefert wichtige Informationen zur Regulation des Gesamt-GA-Gehalts in Wurzeln^15,16. Die RGA-Expression variiert jedoch zwischen verschiedenen Geweben¹⁷ und wird durch GA reguliert¹⁸. Daher kann eine differentielle Expression des RGA-Promotors das mit RGA-GFP beobachtete Fluoreszenzmuster verursachen, weshalb diese Methode nicht quantitativ ist. Kürzlich wurde durch bioaktives Fluorescein (Fl)-markiertes GA^19,20 die Akkumulation von GA im Wurzelendocortex und die Regulation seines zellulären Gehalts durch GA-Transport nachgewiesen. Der GA-FRET-Sensor nlsGPS1 zeigte kürzlich, dass der GA-Gehalt mit der Zellstreckung in Wurzeln, Filamenten und im Dunkeln gewachsenen Hypokotylen korreliert²¹. Wie bereits erwähnt, ist die GA-Konzentration jedoch nicht der einzige Parameter, der die GA-Signalaktivität steuert, da diese von komplexen Sensorprozessen abhängt. Aufbauend auf unserem Verständnis der DELLA- und GA-Signalwege berichten wir hier über die Entwicklung und Charakterisierung eines auf Degradation basierenden ratiometrischen Biosensors für GA-Signale. Für die Entwicklung dieses quantitativen Biosensors verwendeten wir ein mutiertes, GA-sensitives RGA-Protein, das mit einem fluoreszierenden Protein fusioniert und ubiquitär in Geweben exprimiert wurde, sowie ein GA-insensitives fluoreszierendes Protein. Wir zeigen, dass die mutierten RGA-Proteinfusionen bei ubiquitärer Expression die endogene GA-Signalübertragung nicht beeinträchtigen und dass dieser Biosensor die Signalaktivität, die sowohl durch GA-Input als auch durch die GA-Signalverarbeitung im Sensorapparat entsteht, mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung quantifizieren kann. Wir nutzten diesen Biosensor, um die räumliche und zeitliche Verteilung der GA-Signalaktivität zu kartieren und zu quantifizieren, wie GA das Zellverhalten in der SAM-Epidermis reguliert. Wir zeigen, dass GA die Orientierung der Teilungsebene von SAM-Zellen zwischen den Organanlagen reguliert und somit die kanonische Zellorganisation des Internodiums definiert.
Abschließend untersuchten wir, ob qmRGA Veränderungen des endogenen GA-Spiegels in wachsenden Hypokotylen erfassen kann. Wir hatten zuvor gezeigt, dass Nitrat das Wachstum durch Steigerung der GA-Synthese und damit einhergehenden Abbau von DELLA34 stimuliert. Dementsprechend beobachteten wir, dass die Hypokotyllänge von pUBQ10::qmRGA-Keimlingen, die unter reichlicher Nitratversorgung (10 mM NO₃⁻) wuchsen, signifikant größer war als die von Keimlingen unter Nitratmangelbedingungen (Abb. S6a). Entsprechend der Wachstumsreaktion waren die GA-Signale in den Hypokotylen von Keimlingen, die unter 10 mM NO₃⁻-Bedingungen wuchsen, höher als in Keimlingen, die ohne Nitrat wuchsen (Abb. S6b, c). Somit ermöglicht qmRGA auch die Überwachung von Veränderungen der GA-Signalgebung, die durch endogene Veränderungen der GA-Konzentration induziert werden.
Um zu verstehen, ob die mittels qmRGA detektierte GA-Signalaktivität, wie aufgrund des Sensordesigns erwartet, von der GA-Konzentration und der GA-Wahrnehmung abhängt, analysierten wir die Expression der drei GID1-Rezeptoren in vegetativen und reproduktiven Geweben. In Keimlingen zeigte die GID1-GUS-Reporterlinie eine hohe Expression von GID1a und c in den Keimblättern (Abb. 3a–c). Darüber hinaus wurden alle drei Rezeptoren in Blättern, Seitenwurzelprimordien, Wurzelspitzen (mit Ausnahme der Wurzelhaube von GID1b) und dem Gefäßsystem exprimiert (Abb. 3a–c). Im Blütenstandsapikalmeristem (SAM) detektierten wir GUS-Signale nur für GID1b und 1c (Abb. S7a–c). Die In-situ-Hybridisierung bestätigte diese Expressionsmuster und zeigte darüber hinaus, dass GID1c gleichmäßig in niedrigen Konzentrationen im SAM exprimiert wurde, während GID1b eine höhere Expression an der Peripherie des SAM aufwies (Abb. S7d–l). Die Translationsfusion pGID1b::2xmTQ2-GID1b zeigte zudem ein abgestuftes Expressionsmuster von GID1b, von geringer oder fehlender Expression im Zentrum des Sprossapikalmeristems (SAM) bis hin zu hoher Expression an den Organgrenzen (Abb. S7m). GID1-Rezeptoren sind demnach nicht gleichmäßig über und innerhalb von Geweben verteilt. In nachfolgenden Experimenten beobachteten wir außerdem, dass die Überexpression von GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) die Sensitivität von qmRGA in Hypokotylen gegenüber externer GA-Applikation erhöhte (Abb. 3d, e). Im Gegensatz dazu war die mit qd17mRGA im Hypokotyl gemessene Fluoreszenz unempfindlich gegenüber einer GA3-Behandlung (Abb. 3f, g). Für beide Assays wurden Keimlinge mit hohen GA-Konzentrationen (100 μM GA3) behandelt, um das schnelle Verhalten des Sensors zu untersuchen, bei dem die Bindungsfähigkeit an den GID1-Rezeptor erhöht oder aufgehoben wurde. Zusammen bestätigen diese Ergebnisse, dass der qmRGA-Biosensor eine kombinierte Funktion als GA- und GA-Sensor erfüllt, und legen nahe, dass die differentielle Expression des GID1-Rezeptors die Emissivität des Sensors signifikant modulieren kann.
Die Verteilung von GA-Signalen im Sprossapikalmeristem (SAM) ist bisher unklar. Daher verwendeten wir qmRGA-exprimierende Pflanzen und den Stammzellreporter pCLV3::mCherry-NLS³⁵, um hochauflösende quantitative Karten der GA-Signalaktivität zu erstellen. Unser Fokus lag dabei auf der L1-Schicht (Epidermis; Abb. 4a, b, siehe Methoden und Ergänzende Methoden), da L1 eine Schlüsselrolle bei der Steuerung des SAM-Wachstums spielt³⁶. Die Expression von pCLV3::mCherry-NLS diente als fester geometrischer Referenzpunkt für die Analyse der räumlich-zeitlichen Verteilung der GA-Signalaktivität³⁷. Obwohl GA als essenziell für die Entwicklung lateraler Organe gilt⁴, beobachteten wir ab dem P3-Stadium niedrige GA-Signale im Blütenprimordium (P), während junge P1- und P2-Primordien eine moderate Aktivität aufwiesen, ähnlich der im zentralen Bereich (Abb. 4a, b). Eine erhöhte GA-Signalaktivität wurde an den Grenzen der Organprimordien nachgewiesen, beginnend bei P1/P2 (an den Rändern der Grenze) und mit einem Maximum bei P4, sowie in allen Zellen der peripheren Region zwischen den Primordien (Abb. 4a, b und Abb. S8a, b). Diese erhöhte GA-Signalaktivität wurde nicht nur in der Epidermis, sondern auch in den Schichten L2 und der oberen Schicht L3 beobachtet (Abb. S8b). Das mit qmRGA im SAM detektierte GA-Signalmuster blieb über die Zeit unverändert (Abb. S8c–f, k). Obwohl das qd17mRGA-Konstrukt im SAM von T3-Pflanzen aus fünf unabhängigen Linien, die wir detailliert charakterisiert haben, systematisch herunterreguliert war, konnten wir die mit dem pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP-Konstrukt erhaltenen Fluoreszenzmuster analysieren (Abb. S8g–j, l). In dieser Kontrolllinie wurden im SAM nur geringfügige Veränderungen des Fluoreszenzverhältnisses festgestellt, im SAM-Zentrum hingegen beobachteten wir einen deutlichen und unerwarteten Rückgang von VENUS, das mit TagBFP assoziiert ist. Dies bestätigt, dass das mittels qmRGA beobachtete Signalmuster den GA-abhängigen Abbau von mRGA-VENUS widerspiegelt, zeigt aber auch, dass qmRGA die GA-Signalaktivität im Meristemzentrum überschätzen kann. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse ein GA-Signalmuster, das primär die Verteilung der Primordien widerspiegelt. Diese Verteilung der interprimordialen Region (IPR) ist auf den allmählichen Aufbau einer hohen GA-Signalaktivität zwischen dem sich entwickelnden Primordium und der zentralen Region zurückzuführen, während gleichzeitig die GA-Signalaktivität im Primordium abnimmt (Abb. 4c, d).
Die Verteilung der GID1b- und GID1c-Rezeptoren (siehe oben) legt nahe, dass die unterschiedliche Expression von GA-Rezeptoren das Muster der GA-Signalaktivität im Sprossapikalmeristem (SAM) mitprägt. Wir fragten uns, ob eine unterschiedliche Akkumulation von GA daran beteiligt sein könnte. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, verwendeten wir den GA-FRET-Sensor nlsGPS1²¹. Eine erhöhte Aktivierungsfrequenz wurde im SAM von nlsGPS1 nachgewiesen, das 100 min lang mit 10 μM GA⁴⁺⁷ behandelt wurde (Abb. S9a–e). Dies deutet darauf hin, dass nlsGPS1, ähnlich wie in Wurzeln²¹, auf Veränderungen der GA-Konzentration im SAM reagiert. Die räumliche Verteilung der nlsGPS1-Aktivierungsfrequenz zeigte relativ niedrige GA-Konzentrationen in den äußeren Schichten des SAM, jedoch erhöhte Konzentrationen im Zentrum und an den Rändern (Abb. 4e und Abb. S9a,c). Dies legt nahe, dass GA im SAM ebenfalls mit einem räumlichen Verteilungsmuster vorliegt, das dem von qmRGA ermittelten vergleichbar ist. Ergänzend dazu behandelten wir das SAM mit fluoreszierendem GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) oder Fl allein als Negativkontrolle. Das Fl-Signal war im gesamten SAM verteilt, einschließlich der zentralen Region und des Primordiums, wenn auch mit geringerer Intensität (Abb. 4j und Abb. S10d). Im Gegensatz dazu akkumulierten sich alle drei GA-Fl spezifisch innerhalb der Primordiumgrenzen und in unterschiedlichem Ausmaß im restlichen IPR, wobei sich GA7-Fl im größten Bereich des IPR anreicherte (Abb. 4k und Abb. S10a,b). Die Quantifizierung der Fluoreszenzintensität ergab, dass das Verhältnis der Intensität im IPR zur Intensität außerhalb des IPR im GA-Fl-behandelten SAM höher war als im Fl-behandelten SAM (Abb. 4l und Abb. S10c). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass GA in IPR-Zellen, die sich in unmittelbarer Nähe der Organgrenze befinden, in höheren Konzentrationen vorliegt. Dies deutet darauf hin, dass das Muster der GA-Signalaktivität im SAM sowohl auf einer unterschiedlichen Expression von GA-Rezeptoren als auch auf einer unterschiedlichen Akkumulation von GA in IPR-Zellen nahe den Organgrenzen beruht. Unsere Analyse ergab somit ein unerwartetes räumlich-zeitliches Muster der GA-Signalgebung mit geringerer Aktivität im Zentrum und im Primordium des SAM und höherer Aktivität in den IPR-Zellen der peripheren Region.
Um die Rolle der differenziellen GA-Signalaktivität im SAM zu verstehen, analysierten wir die Korrelation zwischen GA-Signalaktivität, Zellwachstum und Zellteilung mittels Echtzeit-Zeitrafferaufnahmen des SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Aufgrund der Rolle von GA in der Wachstumsregulation wurde eine positive Korrelation mit den Parametern des Zellwachstums erwartet. Daher verglichen wir zunächst Karten der GA-Signalaktivität mit Karten der Zelloberflächenwachstumsrate (als Indikator für die Stärke des Zellwachstums einer einzelnen Zelle und ihrer Tochterzellen bei der Teilung) sowie mit Karten der Wachstumsanisotropie, die die Richtung des Zellwachstums misst (ebenfalls hier für eine einzelne Zelle und ihre Tochterzellen bei der Teilung verwendet; Abb. 5a,b, siehe Methoden und Ergänzende Methoden). Unsere Karten der SAM-Zelloberflächenwachstumsrate stimmen mit früheren Beobachtungen überein^38,39, mit minimalen Wachstumsraten am Rand und maximalen Wachstumsraten in sich entwickelnden Blüten (Abb. 5a). Die Hauptkomponentenanalyse (PCA) zeigte, dass die GA-Signalaktivität negativ mit der Intensität des Zelloberflächenwachstums korreliert war (Abb. 5c). Wir zeigten außerdem, dass die Hauptachsen der Variation, einschließlich GA-Signalisierung und Wachstumsintensität, orthogonal zur durch hohe CLV3-Expression bestimmten Richtung verlaufen. Dies bestätigt den Ausschluss von Zellen aus dem SAM-Zentrum in den weiteren Analysen. Die Spearman-Korrelationsanalyse bestätigte die PCA-Ergebnisse (Abbildung 5d) und zeigte, dass höhere GA-Signale in der IPR nicht zu einer stärkeren Zellausdehnung führten. Die Korrelationsanalyse ergab jedoch eine schwache positive Korrelation zwischen GA-Signalaktivität und Wachstumsanisotropie (Abbildung 5c, d). Dies deutet darauf hin, dass eine stärkere GA-Signalisierung in der IPR die Richtung des Zellwachstums und möglicherweise die Lage der Zellteilungsebene beeinflusst.
a, b Heatmaps des mittleren Oberflächenwachstums (a) und der Wachstumsanisotropie (b) im SAM, gemittelt über sieben unabhängige Pflanzen (als Indikatoren für Stärke bzw. Richtung der Zellausdehnung). c Die PCA-Analyse umfasste folgende Variablen: GA-Signal, Oberflächenwachstumsintensität, Oberflächenwachstumsanisotropie und CLV3-Expression. Die erste PCA-Komponente korrelierte hauptsächlich negativ mit der Oberflächenwachstumsintensität und positiv mit dem GA-Signal. Die zweite PCA-Komponente korrelierte hauptsächlich positiv mit der Oberflächenwachstumsanisotropie und negativ mit der CLV3-Expression. Die Prozentangaben repräsentieren die durch die jeweilige Komponente erklärte Varianz. d Spearman-Korrelationsanalyse zwischen GA-Signal, Oberflächenwachstumsintensität und Oberflächenwachstumsanisotropie auf Gewebeebene (ohne CZ). Die Zahl rechts gibt den Spearman-Rho-Wert zwischen zwei Variablen an. Asteriske kennzeichnen hochsignifikante Korrelationen/negative Korrelationen. e 3D-Visualisierung von Col-0 SAM L1-Zellen mittels Konfokalmikroskopie. Die nach 10 h im SAM (jedoch nicht im Primordium) gebildeten neuen Zellwände sind entsprechend ihrer Winkelwerte farblich dargestellt. Die Farbskala befindet sich unten rechts. Die Einlage zeigt das entsprechende 3D-Bild zum Zeitpunkt 0 h. Das Experiment wurde zweimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. f Boxplots zeigen die Zellteilungsraten im IPR- und Nicht-IPR-Col-0-SAM (n = 10 unabhängige Pflanzen). Die Mittellinie markiert den Median, die Boxgrenzen das 25. und 75. Perzentil. Die Whisker zeigen die mit der R-Software ermittelten Minimal- und Maximalwerte. Die p-Werte wurden mit dem zweiseitigen Welch-t-Test berechnet. g, h Schematische Darstellung: (g) Messung des Winkels der neuen Zellwand (magenta) relativ zur radialen Richtung vom Zentrum des SAM (weiße gestrichelte Linie) (nur spitze Winkel von 0–90° werden berücksichtigt) und (h) die zirkumferentielle/laterale und radiale Richtung innerhalb des Meristems. i Häufigkeitsverteilungen der Zellteilungsebenenorientierung im SAM (dunkelblau), IPR (mittelblau) und außerhalb des IPR (hellblau). Die p-Werte wurden mittels zweiseitigem Kolmogorov-Smirnov-Test ermittelt. Das Experiment wurde zweimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. j Häufigkeitsverteilungen der Zellteilungsebenenorientierung des IPR um P3 (hellgrün), P4 (mittelgrün) und P5 (dunkelgrün). Die p-Werte wurden mittels zweiseitigem Kolmogorov-Smirnov-Test ermittelt. Das Experiment wurde zweimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.
Daher untersuchten wir anschließend den Zusammenhang zwischen GA-Signalgebung und Zellteilungsaktivität, indem wir während des Assays neu gebildete Zellwände identifizierten (Abb. 5e). Dieser Ansatz ermöglichte es uns, Häufigkeit und Richtung der Zellteilung zu messen. Überraschenderweise stellten wir fest, dass die Häufigkeit der Zellteilungen im IPR und im restlichen SAM (Nicht-IPR, Abb. 5f) ähnlich war. Dies deutet darauf hin, dass Unterschiede in der GA-Signalgebung zwischen IPR- und Nicht-IPR-Zellen die Zellteilung nicht signifikant beeinflussen. Diese Beobachtung sowie die positive Korrelation zwischen GA-Signalgebung und Wachstumsanisotropie veranlassten uns zu untersuchen, ob die GA-Signalgebungsaktivität die Orientierung der Zellteilungsebene beeinflussen könnte. Wir maßen die Orientierung der neuen Zellwand als spitzen Winkel relativ zur radialen Achse, die das Meristemzentrum mit dem Zentrum der neuen Zellwand verbindet (Abb. 5e–i), und beobachteten eine deutliche Tendenz der Zellen, sich in Winkeln nahe 90° relativ zur radialen Achse zu teilen. Die höchsten Frequenzen wurden bei 70–80° (23,28 %) und 80–90° (22,62 %) beobachtet (Abb. 5e,i), was Zellteilungen in Umfangs-/Querrichtung entspricht (Abb. 5h). Um den Beitrag der GA-Signalgebung zu diesem Zellteilungsverhalten zu untersuchen, analysierten wir die Zellteilungsparameter in IPR und Nicht-IPR separat (Abb. 5i). Wir beobachteten, dass sich die Verteilung der Teilungswinkel in IPR-Zellen von der in Nicht-IPR-Zellen oder in Zellen des gesamten Sprossapikalmeristems (SAM) unterschied. IPR-Zellen zeigten einen höheren Anteil lateraler/zirkulärer Zellteilungen, d. h. 70–80° und 80–90° (entsprechende Anteile: 33,86 % bzw. 30,71 %) (Abb. 5i). Unsere Beobachtungen ergaben somit einen Zusammenhang zwischen hoher GA-Signalgebung und einer nahezu zirkumferenziellen Ausrichtung der Zellteilungsebene, ähnlich der Korrelation zwischen GA-Signalaktivität und Wachstumsanisotropie (Abb. 5c, d). Um die räumliche Konservierung dieses Zusammenhangs weiter zu untersuchen, maßen wir die Ausrichtung der Teilungsebene in IPR-Zellen um das Primordium ab P3, da in dieser Region ab P4 die höchste GA-Signalaktivität nachgewiesen wurde (Abb. 4). Die Teilungswinkel der IPR um P3 und P4 zeigten keine statistisch signifikanten Unterschiede, obwohl in den IPR um P4 eine erhöhte Häufigkeit lateraler Zellteilungen beobachtet wurde (Abb. 5j). In den IPR-Zellen um P5 wurde der Unterschied in der Orientierung der Zellteilungsebene jedoch statistisch signifikant, mit einem starken Anstieg der Häufigkeit transversaler Zellteilungen (Abb. 5j). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass GA-Signalisierung die Orientierung der Zellteilungen im SAM steuern kann, was mit früheren Berichten^40,41 übereinstimmt, wonach eine hohe GA-Signalisierung eine laterale Orientierung der Zellteilungen im IPR induzieren kann.
Es wird angenommen, dass Zellen im IPR nicht in Primordien, sondern in Internodien eingebaut werden.^2,42,43 Die transversale Ausrichtung der Zellteilungen im IPR könnte zur typischen Anordnung paralleler Längsreihen von Epidermiszellen in den Internodien führen. Unsere oben beschriebenen Beobachtungen legen nahe, dass die GA-Signalgebung durch die Regulierung der Zellteilungsrichtung wahrscheinlich eine Rolle in diesem Prozess spielt.
Der Funktionsverlust mehrerer DELLA-Gene führt zu einer konstitutiven GA-Antwort, und della-Mutanten können zur Überprüfung dieser Hypothese verwendet werden⁴⁴. Zunächst analysierten wir die Expressionsmuster von fünf DELLA-Genen im Sprossapikalmeristem (SAM). Die Transkriptionsfusion der GUS-Linie⁴⁵ zeigte, dass GAI, RGA, RGL1 und RGL2 (in deutlich geringerem Maße) im SAM exprimiert werden (Abb. S11a–d). Die In-situ-Hybridisierung zeigte weiterhin, dass sich GAI-mRNA spezifisch in Primordien und sich entwickelnden Blüten anreichert (Abb. S11e). RGL1- und RGL3-mRNA wurden im gesamten SAM-Bereich und in älteren Blüten nachgewiesen, während RGL2-mRNA vermehrt in der Randregion vorkam (Abb. S11f–h). Konfokale Mikroskopie des pRGL3::RGL3-GFP-SAM bestätigte die mittels In-situ-Hybridisierung beobachtete Expression und zeigte, dass sich das RGL3-Protein im zentralen Bereich des SAM anreichert (Abb. S11i). Mithilfe der pRGA::GFP-RGA-Linie stellten wir ebenfalls eine Anreicherung des RGA-Proteins im SAM fest, dessen Menge jedoch ab P4 zum Rand hin abnimmt (Abb. S11j). Bemerkenswerterweise korrelieren die Expressionsmuster von RGL3 und RGA mit einer höheren GA-Signalaktivität im IPR, die mittels qmRGA nachgewiesen wurde (Abb. 4). Darüber hinaus deuten diese Daten darauf hin, dass alle DELLAs im SAM exprimiert werden und ihre Expression sich über den gesamten SAM erstreckt.
Anschließend analysierten wir die Zellteilungsparameter im Wildtyp-SAM (Ler, Kontrolle) und den gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della Fünffachmutanten (global) (Abb. 6a, b). Interessanterweise beobachteten wir eine statistisch signifikante Verschiebung in der Verteilung der Zellteilungswinkelhäufigkeiten im SAM der della-globalen Mutante im Vergleich zum Wildtyp (Abb. 6c). Diese Veränderung in der della-globalen Mutante beruhte auf einer erhöhten Häufigkeit von 80–90°-Winkeln (34,71 % vs. 24,55 %) und, in geringerem Maße, von 70–80°-Winkeln (23,78 % vs. 20,18 %), d. h. entsprechend transversalen Zellteilungen (Abb. 6c). Die Häufigkeit nicht-transversaler Teilungen (0–60°) war in der della-globalen Mutante ebenfalls geringer (Abb. 6c). Die Häufigkeit transversaler Zellteilungen war im SAM der globalen della-Mutante signifikant erhöht (Abb. 6b). Auch im IPR war die Häufigkeit transversaler Zellteilungen in der globalen della-Mutante im Vergleich zum Wildtyp höher (Abb. 6d). Außerhalb des IPR-Bereichs zeigte der Wildtyp eine gleichmäßigere Verteilung der Zellteilungswinkel, während die globale della-Mutante tangentiale Teilungen wie im IPR bevorzugte (Abb. 6e). Wir quantifizierten außerdem die Orientierung der Zellteilungen im SAM von ga2-Oxidase (ga2ox)-Fünffachmutanten (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 und ga2ox6-2), einem GA-inaktiven Mutantenhintergrund, in dem sich GA anreichert. Entsprechend dem Anstieg des GA-Gehalts war das SAM der fünffachen ga2ox-Mutante größer als das von Col-0 (Abb. S12a, b). Im Vergleich zu Col-0 zeigte das fünffache ga2ox-SAM eine deutlich veränderte Verteilung der Zellteilungswinkel, wobei die Winkelhäufigkeit von 50° auf 90° anstieg, was wiederum tangentiale Teilungen begünstigte (Abb. S12a–c). Somit zeigen wir, dass die konstitutive Aktivierung der GA-Signalübertragung und die GA-Akkumulation laterale Zellteilungen im IPR und im restlichen SAM induzieren.
a, b 3D-Visualisierung der L1-Schicht des PI-gefärbten SAM von Ler (a) und der globalen della-Mutante (b) mittels Konfokalmikroskopie. Die im SAM (jedoch nicht im Primordium) über einen Zeitraum von 10 h neu gebildeten Zellwände sind dargestellt und entsprechend ihren Winkelwerten farblich markiert. Der Ausschnitt zeigt das SAM bei 0 h. Die Farbskala befindet sich in der unteren rechten Ecke. Der Pfeil in (b) markiert ein Beispiel ausgerichteter Zellreihen in der globalen della-Mutante. Das Experiment wurde zweimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. c Vergleich der Häufigkeitsverteilung der Zellteilungsebenenorientierungen im gesamten SAM (d), im IPR (e) und im Nicht-IPR (f) zwischen Ler und der globalen della-Mutante. Die p-Werte wurden mittels zweiseitigem Kolmogorov-Smirnov-Test ermittelt. f, g 3D-Visualisierung von Konfokalmikroskopiebildern des PI-gefärbten SAM von Col-0 (i) und pCUC2::gai-1-VENUS (j) transgenen Pflanzen. Die Abbildungen (a, b) zeigen die Bildung neuer Zellwände (jedoch nicht von Zellprimordien) im SAM innerhalb von 10 h. Das Experiment wurde zweimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. h–j Vergleich der Häufigkeitsverteilung der Orientierungen der Zellteilungsebenen im gesamten SAM (h), in der IPR (i) und außerhalb der IPR (j) zwischen Col-0- und pCUC2::gai-1-VENUS-Pflanzen. Die p-Werte wurden mittels zweiseitigem Kolmogorov-Smirnov-Test ermittelt.
Anschließend untersuchten wir die Wirkung einer spezifischen Hemmung der GA-Signalübertragung im IPR. Dazu nutzten wir den Cotyledon-Cup-2-(CUC2)-Promotor, um die Expression eines dominant-negativen gai-1-Proteins, fusioniert mit VENUS, zu steuern (in der pCUC2::gai-1-VENUS-Linie). Im Wildtyp-SAM steuert der CUC2-Promotor ab P4 die Expression der meisten IPRs im SAM, einschließlich der Randzellen. Eine ähnliche spezifische Expression wurde in pCUC2::gai-1-VENUS-Pflanzen beobachtet (siehe unten). Die Verteilung der Zellteilungswinkel im SAM bzw. IPR von pCUC2::gai-1-VENUS-Pflanzen unterschied sich nicht signifikant von der des Wildtyps. Unerwarteterweise stellten wir jedoch fest, dass sich Zellen ohne IPR in diesen Pflanzen häufiger mit einem Winkel von 80–90° teilten (Abb. 6f–j).
Es wurde vermutet, dass die Richtung der Zellteilung von der Geometrie des Sprossapikalmeristems (SAM) abhängt, insbesondere von der durch die Gewebekrümmung erzeugten Zugspannung⁴⁶. Daher untersuchten wir, ob die Form des SAM in der globalen della-Mutante und in pCUC2::gai-1-VENUS-Pflanzen verändert ist. Wie bereits berichtet¹², war das SAM der globalen della-Mutante größer als das des Wildtyps (Abb. S13a, b, d). Die In-situ-Hybridisierung von CLV3- und STM-RNA bestätigte die Meristemexpansion in della-Mutanten und zeigte darüber hinaus die laterale Ausdehnung der Stammzellnische (Abb. S13e, f, h, i). Die Krümmung des SAM war jedoch in beiden Genotypen ähnlich (Abb. S13k, m, n, p). Wir beobachteten eine ähnliche Größenzunahme in der gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della Vierfachmutante ohne Veränderung der Krümmung im Vergleich zum Wildtyp (Abb. S13c, d, g, j, l, o, p). Die Häufigkeit der Zellteilungsorientierung war in der della Vierfachmutante ebenfalls beeinflusst, jedoch in geringerem Maße als in der della monolithischen Mutante (Abb. S12d–f). Dieser Dosiseffekt, zusammen mit dem fehlenden Effekt auf die Krümmung, deutet darauf hin, dass die Restaktivität von RGL3 in der della Vierfachmutante die durch den Verlust der DELLA-Aktivität verursachten Veränderungen der Zellteilungsorientierung begrenzt und dass Veränderungen der lateralen Zellteilungen als Reaktion auf Veränderungen der GA-Signalaktivität und nicht auf Veränderungen der SAM-Geometrie auftreten. Wie oben beschrieben, steuert der CUC2-Promotor die IPR-Expression im SAM ab P4 (Ergänzende Abb. 14a, b). Im Gegensatz dazu wies das pCUC2::gai-1-VENUS-SAM eine reduzierte Größe, aber eine höhere Krümmung auf (Ergänzende Abb. 14c–h). Diese Veränderung der SAM-Morphologie in pCUC2::gai-1-VENUS könnte zu einer veränderten Verteilung der mechanischen Spannungen im Vergleich zum Wildtyp führen, bei dem hohe Umfangsspannungen in kürzerer Entfernung vom SAM-Zentrum auftreten⁴⁷. Alternativ könnten die Veränderungen der SAM-Morphologie in pCUC2::gai-1-VENUS auf durch die Transgenexpression induzierte Veränderungen der regionalen mechanischen Eigenschaften zurückzuführen sein⁴⁸. In beiden Fällen könnte dies die Auswirkungen von Veränderungen der GA-Signalgebung teilweise kompensieren, indem die Wahrscheinlichkeit einer Zellteilung in Umfangs-/Querrichtung erhöht wird, was unsere Beobachtungen erklärt.
Zusammengenommen bestätigen unsere Daten, dass eine erhöhte GA-Signalgebung eine aktive Rolle bei der lateralen Ausrichtung der Zellteilungsebene im IPR spielt. Sie zeigen außerdem, dass die Meristemkrümmung ebenfalls Einfluss auf die Ausrichtung der Zellteilungsebene im IPR hat.
Die transversale Ausrichtung der Teilungsebene im IPR, bedingt durch eine hohe GA-Signalaktivität, deutet darauf hin, dass GA innerhalb des SAM eine radiale Zellreihe in der Epidermis vororganisiert, um die später im epidermalen Internodium zu findende Zellorganisation festzulegen. Solche Zellreihen waren tatsächlich häufig in SAM-Aufnahmen von della-Globalmutanten sichtbar (Abb. 6b). Um die entwicklungsbiologische Funktion des räumlichen Musters der GA-Signalgebung im SAM weiter zu untersuchen, analysierten wir die räumliche Zellorganisation im IPR von Wildtyp-Pflanzen (Ler und Col-0), della-Globalmutanten und pCUC2::gai-1-VENUS-Transgenpflanzen mittels Zeitrafferaufnahmen.
Wir stellten fest, dass die GA-Signalaktivität im IPR mittels qmRGA von P1/P2 zunahm und bei P4 ihren Höhepunkt erreichte. Dieses Muster blieb über die Zeit konstant (Abb. 4a–f und Abb. S8c–f, k). Um die räumliche Organisation der Zellen im IPR bei zunehmendem GA-Signal zu analysieren, markierten wir Ler-IPR-Zellen oberhalb und seitlich von P4 entsprechend ihrem Entwicklungsschicksal, das 34 h nach der ersten Beobachtung analysiert wurde. Dies entsprach mehr als dem Zweifachen der Plastidenentwicklung und ermöglichte es uns, die IPR-Zellen während der Primordiumentwicklung von P1/P2 bis P4 zu verfolgen. Wir verwendeten drei verschiedene Farben: Gelb für Zellen, die sich in das Primordium nahe P4 integrierten, Grün für Zellen im IPR und Lila für Zellen, die an beiden Prozessen beteiligt waren (Abb. 7a–c). Zum Zeitpunkt t0 (0 h) waren 1–2 Schichten von IPR-Zellen vor P4 sichtbar (Abb. 7a). Wie erwartet, teilten sich diese Zellen hauptsächlich entlang der transversalen Teilungsebene (Abb. 7a–c). Ähnliche Ergebnisse wurden mit Col-0 SAM erzielt (mit Fokus auf P3, dessen Rand sich ähnlich wie P4 in Ler faltet), obwohl in diesem Genotyp die Faltung am Blütenrand die IPR-Zellen schneller verdeckte (Abb. 7g–i). Das Teilungsmuster der IPR-Zellen präorganisiert diese somit in radiale Reihen, ähnlich wie in Internodien. Die Organisation radialer Reihen und die Lokalisation der IPR-Zellen zwischen aufeinanderfolgenden Organen legen nahe, dass es sich bei diesen Zellen um internodale Vorläuferzellen handelt.
Wir haben hier einen ratiometrischen GA-Signal-Biosensor, qmRGA, entwickelt, der die quantitative Kartierung der GA-Signalaktivität infolge kombinierter GA- und GA-Rezeptorkonzentrationen ermöglicht und gleichzeitig die Beeinträchtigung endogener Signalwege minimiert. Dadurch liefert er Informationen zur GA-Funktion auf zellulärer Ebene. Zu diesem Zweck konstruierten wir ein modifiziertes DELLA-Protein, mRGA, das die Fähigkeit zur Bindung von DELLA-Interaktionspartnern verloren hat, aber weiterhin empfindlich auf GA-induzierte Proteolyse reagiert. qmRGA reagiert sowohl auf exogene als auch auf endogene Veränderungen des GA-Spiegels, und seine dynamischen Sensoreigenschaften ermöglichen die Beurteilung räumlich-zeitlicher Veränderungen der GA-Signalaktivität während der Entwicklung. qmRGA ist zudem ein sehr flexibles Werkzeug, da es durch Änderung des für seine Expression verwendeten Promotors (falls erforderlich) an verschiedene Gewebe angepasst werden kann. Angesichts der konservierten Natur des GA-Signalwegs und des PFYRE-Motivs bei Angiospermen ist es wahrscheinlich auf andere Spezies übertragbar.²² In Übereinstimmung damit wurde gezeigt, dass eine äquivalente Mutation im Reis-SLR1-DELLA-Protein (HYY497AAA) die wachstumsrepressive Aktivität von SLR1 unterdrückt, während der GA-vermittelte Abbau, ähnlich wie bei mRGA23, nur geringfügig reduziert wird. Bemerkenswerterweise zeigten neuere Studien an Arabidopsis, dass eine einzelne Aminosäuremutation in der PFYRE-Domäne (S474L) die Transkriptionsaktivität von RGA veränderte, ohne dessen Interaktionsfähigkeit mit Transkriptionsfaktorpartnern zu beeinträchtigen⁵⁰. Obwohl diese Mutation den drei in mRGA vorhandenen Aminosäuresubstitutionen sehr ähnlich ist, zeigen unsere Studien, dass diese beiden Mutationen unterschiedliche Eigenschaften von DELLA verändern. Obwohl die meisten Transkriptionsfaktorpartner an die LHR1- und SAW-Domänen von DELLA binden²⁶,⁵¹, könnten einige konservierte Aminosäuren in der PFYRE-Domäne zur Stabilisierung dieser Interaktionen beitragen.
Die Internodienentwicklung ist ein Schlüsselmerkmal für die Pflanzenarchitektur und Ertragssteigerung. Mittels quantitativer Reverse-Genetikanalyse (qRGA) konnte eine höhere GA-Signalaktivität in den IPR-Internodien-Vorläuferzellen nachgewiesen werden. Durch die Kombination von quantitativer Bildgebung und Genetik zeigten wir, dass GA-Signalmuster kreisförmige/transversale Zellteilungsebenen in der SAM-Epidermis überlagern und so die für die Internodienentwicklung notwendige Zellteilungsorganisation prägen. Mehrere Regulatoren der Zellteilungsebenenorientierung wurden während der Entwicklung identifiziert^52,53. Unsere Arbeit liefert ein klares Beispiel dafür, wie die GA-Signalaktivität diesen zellulären Parameter reguliert. DELLA kann mit Präfaltungsproteinkomplexen interagieren⁴¹, daher könnte die GA-Signalisierung die Zellteilungsebenenorientierung durch direkte Beeinflussung der kortikalen Mikrotubuli-Orientierung regulieren^40,41,54,55. Unerwarteterweise konnten wir zeigen, dass im SAM die höhere GA-Signalaktivität nicht mit Zellstreckung oder -teilung, sondern ausschließlich mit Wachstumsanisotropie korreliert, was mit einem direkten Effekt von GA auf die Richtung der Zellteilung im IPR übereinstimmt. Wir können jedoch nicht ausschließen, dass dieser Effekt auch indirekt ist, beispielsweise durch eine GA-induzierte Zellwanderweichung vermittelt wird⁵⁶. Veränderungen der Zellwandeigenschaften induzieren mechanischen Stress^57,58, der wiederum die Orientierung der Zellteilungsebene beeinflussen kann, indem er die Orientierung kortikaler Mikrotubuli verändert^39,46,59. Die kombinierte Wirkung von GA-induziertem mechanischem Stress und der direkten Regulation der Mikrotubuli-Orientierung durch GA könnte an der Generierung eines spezifischen Musters der Zellteilungsorientierung in der IPR zur Definition von Internodien beteiligt sein. Weitere Studien sind erforderlich, um diese Hypothese zu überprüfen. Frühere Untersuchungen haben die Bedeutung der DELLA-interagierenden Proteine ​​TCP¹⁴ und TCP¹⁵ für die Kontrolle der Internodienbildung hervorgehoben^60,61. Diese Faktoren könnten zusammen mit BREVIPEDICELLUS (BP) und PENNYWISE (PNY), die die Internodienentwicklung regulieren und nachweislich die GA-Signalübertragung beeinflussen^2,62, die Wirkung von GA vermitteln. Da DELLAs mit Brassinosteroid-, Ethylen-, Jasmonsäure- und Abscisinsäure (ABA)-Signalwegen interagieren63,64 und diese Hormone die Mikrotubuli-Orientierung beeinflussen können65, könnten die Effekte von GA auf die Zellteilungsorientierung auch durch andere Hormone vermittelt werden.
Frühe zytologische Untersuchungen zeigten, dass sowohl die inneren als auch die äußeren Bereiche des Arabidopsis-Sprossapikalmeristems (SAM) für die Internodienentwicklung notwendig sind^2,42. Die Tatsache, dass Gibberellinsäure (GA) die Zellteilung im inneren Gewebe aktiv reguliert¹², stützt die Annahme einer Doppelfunktion von GA bei der Regulation der Meristem- und Internodiengröße im SAM. Auch das Muster der gerichteten Zellteilung ist im inneren SAM-Gewebe streng reguliert, und diese Regulation ist essenziell für das Stammwachstum⁵². Es wäre interessant zu untersuchen, ob GA auch eine Rolle bei der Ausrichtung der Zellteilungsebene in der inneren SAM-Organisation spielt und dadurch die Spezifizierung und Entwicklung der Internodien innerhalb des SAM synchronisiert.
Die Pflanzen wurden in vitro in Erde oder 1x Murashige-Skoog (MS)-Medium (Duchefa) mit 1 % Saccharose und 1 % Agar (Sigma) unter Standardbedingungen (16 h Licht, 22 °C) kultiviert. Ausgenommen hiervon waren Hypokotyl- und Wurzelwachstumsexperimente, bei denen die Sämlinge auf vertikalen Platten unter Dauerlicht und 22 °C angezogen wurden. Für die Nitratexperimente wurden die Pflanzen auf modifiziertem MS-Medium (bioWORLD-Pflanzenmedium) mit ausreichend Nitrat (0 oder 10 mM KNO₃), 0,5 mM NH₄-Succinat, 1 % Saccharose und 1 % A-Agar (Sigma) unter Langtagbedingungen kultiviert.
Die in pDONR221 inserierte GID1a-cDNA wurde mit pDONR P4-P1R-pUBQ10 und pDONR P2R-P3-mCherry in pB7m34GW rekombiniert, um pUBQ10::GID1a-mCherry zu erzeugen. Die in pDONR221 inserierte IDD2-DNA wurde in pB7RWG266 rekombiniert, um p35S:IDD2-RFP zu erzeugen. Zur Erzeugung von pGID1b::2xmTQ2-GID1b wurden zunächst ein 3,9 kb großes Fragment stromaufwärts der GID1b-kodierenden Region und ein 4,7 kb großes Fragment, das die GID1b-cDNA (1,3 kb) und den Terminator (3,4 kb) enthält, mit den Primern in Ergänzungstabelle 3 amplifiziert und anschließend in pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) bzw. pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) inseriert. Schließlich wurde es mit pDONR221 2xmTQ268 mittels Gateway-Klonierung in den Zielvektor pGreen 012567 rekombiniert. Zur Generierung von pCUC2::LSSmOrange wurden die CUC2-Promotorsequenz (3229 bp upstream von ATG), gefolgt von der kodierenden Sequenz des großen Stokes-verschobenen mOrange (LSSmOrange)69 mit dem N7-Kernlokalisierungssignal und dem NOS-Transkriptionsterminator, mithilfe des Gateway-3-Fragment-Rekombinationssystems (Invitrogen) in den Kanamycin-Targeting-Vektor pGreen assembliert. Der pflanzliche Binärvektor wurde in Agrobacterium tumefaciens Stamm GV3101 und anschließend mittels Agrobacterium-Infiltration in Blätter von Nicotiana benthamiana sowie mittels Blütenstands-Tauchverfahren in Arabidopsis thaliana Col-0 eingebracht. pUBQ10::qmRGA, pUBQ10::GID1a-mCherry und pCLV3::mCherry-NLS qmRGA wurden aus den F3- bzw. F1-Nachkommen der entsprechenden Kreuzungen isoliert.
Die RNA-In-situ-Hybridisierung wurde an etwa 1 cm langen Triebspitzen durchgeführt⁷². Diese wurden gesammelt und sofort in auf 4 °C vorgekühlter FAA-Lösung (3,7 % Formaldehyd, 5 % Essigsäure, 50 % Ethanol) fixiert. Nach zweimaliger Vakuumbehandlung (je 15 min) wurde das Fixiermittel gewechselt und die Proben über Nacht inkubiert. Die cDNAs von GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 und RGL3 sowie Antisense-Sonden für deren 3′-UTRs wurden mit den in Tabelle S3 (Zusatzmaterial) aufgeführten Primern gemäß der Beschreibung von Rosier et al.⁷³ synthetisiert. Digoxigenin-markierte Sonden wurden mittels Digoxigenin-Antikörpern (3000-fache Verdünnung; Roche, Katalognummer: 11 093 274 910) immunologisch nachgewiesen, und die Schnitte wurden mit einer Lösung aus 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP, 250-fache Verdünnung) und Nitroblautetrazolium (NBT, 200-fache Verdünnung) gefärbt.