In dieser Studie wurden die stimulierenden Effekte der kombinierten Behandlung untersucht.PflanzenwachstumsregulatorenDie Wirkung von 2,4-D und Kinetin sowie von Eisenoxid-Nanopartikeln (Fe₃O₄-NPs) auf die Morphogenese in vitro und die Produktion sekundärer Pflanzenstoffe in *Hypericum perforatum* L. wurde untersucht. Die optimierte Behandlung [2,4-D (0,5 mg/L) + Kinetin (2 mg/L) + Fe₃O₄-NPs (4 mg/L)] verbesserte die Wachstumsparameter der Pflanzen signifikant: Die Pflanzenhöhe erhöhte sich um 59,6 %, die Wurzellänge um 114,0 %, die Knospenzahl um 180,0 % und das Frischgewicht des Kallus um 198,3 % im Vergleich zur Kontrollgruppe. Diese kombinierte Behandlung steigerte zudem die Regenerationsrate (50,85 %) und erhöhte den Hypericin-Gehalt um 66,6 %. Die GC-MS-Analyse ergab hohe Gehalte an Hyperosid, β-Pathholen und Cetylalkohol, die 93,36 % der gesamten Peakfläche ausmachten, während der Gehalt an Gesamtphenolen und Flavonoiden um bis zu 80,1 % anstieg. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Pflanzenwachstumsregulatoren (PGRs) und Fe₃O₄-Nanopartikel (Fe₃O₄-NPs) synergistisch wirken, indem sie die Organogenese und die Akkumulation bioaktiver Verbindungen stimulieren. Dies stellt eine vielversprechende Strategie zur biotechnologischen Verbesserung von Heilpflanzen dar.
Johanniskraut (Hypericum perforatum L.), auch bekannt als St. Johanniskraut, ist eine mehrjährige krautige Pflanze aus der Familie der Johanniskrautgewächse (Hypericaceae) mit wirtschaftlichem Wert.[1] Zu seinen potenziell bioaktiven Bestandteilen zählen natürliche Tannine, Xanthone, Phloroglucin, Naphthalindianthron (Hyperin und Pseudohyperin), Flavonoide, Phenolsäuren und ätherische Öle.[2,3,4] Johanniskraut lässt sich mit traditionellen Methoden vermehren; die Saisonalität dieser Methoden, die geringe Keimfähigkeit und die Anfälligkeit für Krankheiten schränken jedoch das Potenzial für den großflächigen Anbau und die kontinuierliche Bildung sekundärer Pflanzenstoffe ein.[1,5,6]
Die In-vitro-Gewebekultur gilt daher als effektive Methode zur schnellen Pflanzenvermehrung, zur Erhaltung von Genressourcen und zur Steigerung der Ausbeute an Arzneistoffen [7, 8]. Pflanzenwachstumsregulatoren (PGRs) spielen eine entscheidende Rolle bei der Steuerung der Morphogenese und sind für die In-vitro-Kultivierung von Kallus und ganzen Organismen unerlässlich. Die Optimierung ihrer Konzentrationen und Kombinationen ist für den erfolgreichen Abschluss dieser Entwicklungsprozesse von entscheidender Bedeutung [9]. Daher ist das Verständnis der geeigneten Zusammensetzung und Konzentration von Regulatoren wichtig, um das Wachstum und die Regenerationsfähigkeit von Johanniskraut (H. perforatum) zu verbessern [10].
Eisenoxid-Nanopartikel (Fe₃O₄) sind eine Klasse von Nanopartikeln, die für die Gewebekultur entwickelt wurden bzw. werden. Fe₃O₄ besitzt ausgeprägte magnetische Eigenschaften, gute Biokompatibilität und die Fähigkeit, das Pflanzenwachstum zu fördern und Umweltstress zu reduzieren. Daher hat es in der Gewebekulturentwicklung großes Interesse geweckt. Zu den potenziellen Anwendungen dieser Nanopartikel gehören die Optimierung der In-vitro-Kultur zur Förderung der Zellteilung, die Verbesserung der Nährstoffaufnahme und die Aktivierung antioxidativer Enzyme [11].
Obwohl Nanopartikel nachweislich positive Effekte auf das Pflanzenwachstum haben, sind Studien zur kombinierten Anwendung von Fe₃O₄-Nanopartikeln und optimierten Pflanzenwachstumsregulatoren bei *H. perforatum** rar. Um diese Wissenslücke zu schließen, untersuchte die vorliegende Studie die kombinierten Effekte auf die Morphogenese und die Produktion sekundärer Pflanzenstoffe in vitro, um neue Erkenntnisse zur Verbesserung der Eigenschaften von Heilpflanzen zu gewinnen. Die Studie verfolgt daher zwei Ziele: (1) die Optimierung der Konzentration von Pflanzenwachstumsregulatoren zur effektiven Förderung von Kallusbildung, Sprossregeneration und Bewurzelung in vitro; und (2) die Untersuchung der Auswirkungen von Fe₃O₄-Nanopartikeln auf Wachstumsparameter in vitro. Zukünftig soll die Überlebensrate regenerierter Pflanzen während der Akklimatisierung (in vitro) untersucht werden. Es wird erwartet, dass die Ergebnisse dieser Studie die Mikrovermehrungseffizienz von *H. perforatum* signifikant verbessern und somit zu einer nachhaltigen Nutzung und biotechnologischen Anwendung dieser wichtigen Heilpflanze beitragen.
In dieser Studie wurden Blattexplantate von einjährigen Johanniskrautpflanzen aus Freilandkultur (Mutterpflanzen) gewonnen. Diese Explantate dienten der Optimierung der In-vitro-Kulturbedingungen. Vor der Kultivierung wurden die Blätter mehrere Minuten lang gründlich unter fließendem destilliertem Wasser gespült. Anschließend wurden die Explantatoberflächen durch Eintauchen in 70%iges Ethanol für 30 Sekunden desinfiziert, gefolgt von einem Eintauchen in eine 1,5%ige Natriumhypochloritlösung (NaOCl) mit einigen Tropfen Tween 20 für 10 Minuten. Abschließend wurden die Explantate dreimal mit sterilem destilliertem Wasser gespült, bevor sie in das nächste Kulturmedium überführt wurden.
In den folgenden vier Wochen wurden Parameter der Sprossregeneration gemessen, darunter Regenerationsrate, Sprossanzahl pro Explantat und Sprosslänge. Sobald die regenerierten Sprosse eine Länge von mindestens 2 cm erreicht hatten, wurden sie auf ein Bewurzelungsmedium übertragen, das aus halbstarkem MS-Medium, 0,5 mg/l Indolbuttersäure (IBA) und 0,3 % Guarkernmehl bestand. Die Bewurzelungskultur wurde über drei Wochen fortgesetzt, wobei Bewurzelungsrate, Wurzelanzahl und Wurzellänge gemessen wurden. Jede Behandlung wurde dreimal wiederholt, wobei pro Wiederholung 10 Explantate kultiviert wurden, sodass insgesamt etwa 30 Explantate pro Behandlung erhalten wurden.
Die Pflanzenhöhe wurde in Zentimetern (cm) mit einem Lineal vom Pflanzenfuß bis zur Spitze des höchsten Blattes gemessen. Die Wurzellänge wurde unmittelbar nach dem vorsichtigen Auspflanzen der Sämlinge und dem Entfernen des Anzuchtmediums in Millimetern (mm) gemessen. Die Anzahl der Knospen pro Explantat wurde direkt an jeder Pflanze gezählt. Die Anzahl der schwarzen Flecken auf den Blättern, sogenannte Knötchen, wurde visuell bestimmt. Diese schwarzen Knötchen gelten als Hypericin-haltige Drüsen oder Oxidationsflecken und dienen als physiologischer Indikator für die Reaktion der Pflanze auf die Behandlung. Nach dem vollständigen Entfernen des Anzuchtmediums wurde das Frischgewicht der Sämlinge mit einer elektronischen Waage mit einer Genauigkeit von Milligramm (mg) bestimmt.
Die Methode zur Berechnung der Kallusbildungsrate ist wie folgt: Nach vierwöchiger Kultivierung von Explantaten in einem Medium mit verschiedenen Wachstumsregulatoren (Kinasen, 2,4-D und Fe3O4) wird die Anzahl der Explantate, die Kallus bilden können, gezählt. Die Formel zur Berechnung der Kallusbildungsrate lautet wie folgt:
Jede Behandlung wurde dreimal wiederholt, wobei bei jeder Wiederholung mindestens 10 Explantate untersucht wurden.
Die Regenerationsrate gibt den Anteil des Kallusgewebes an, das nach der Kallusbildungsphase den Knospendifferenzierungsprozess erfolgreich durchläuft. Dieser Indikator belegt die Fähigkeit des Kallusgewebes, sich in differenziertes Gewebe umzuwandeln und zu neuen Pflanzenorganen heranzuwachsen.
Der Bewurzelungskoeffizient ist das Verhältnis der Anzahl der wurzelfähigen Zweige zur Gesamtzahl der Zweige. Dieser Indikator spiegelt den Erfolg der Bewurzelungsphase wider, die für die Mikrovermehrung und Pflanzenvermehrung von entscheidender Bedeutung ist, da eine gute Bewurzelung das Überleben der Sämlinge unter Wachstumsbedingungen verbessert.
Hypericinverbindungen wurden mit 90%igem Methanol extrahiert. Fünfzig mg getrocknetes Pflanzenmaterial wurden in 1 ml Methanol suspendiert und 20 min lang bei 30 kHz in einem Ultraschallbad (Modell A5120-3YJ) bei Raumtemperatur im Dunkeln beschallt. Anschließend wurde die Probe 15 min bei 6000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und die Absorption des Hypericins bei 592 nm mit einem Plus-3000 S Spektralphotometer gemäß der von Conceiçao et al. [14] beschriebenen Methode gemessen.
Die meisten Behandlungen mit Pflanzenwachstumsregulatoren (PGRs) und Eisenoxid-Nanopartikeln (Fe₃O₄-NPs) führten nicht zur Bildung schwarzer Knötchen an regenerierten Triebblättern. Bei keiner der Behandlungen mit 0,5 oder 1 mg/L 2,4-D, 0,5 oder 1 mg/L Kinetin oder 1, 2 oder 4 mg/L Eisenoxid-Nanopartikeln wurden Knötchen beobachtet. Einige Kombinationen zeigten bei höheren Konzentrationen von Kinetin und/oder Eisenoxid-Nanopartikeln einen leichten Anstieg der Knötchenbildung (jedoch nicht statistisch signifikant), beispielsweise die Kombination von 2,4-D (0,5–2 mg/L) mit Kinetin (1–1,5 mg/L) und Eisenoxid-Nanopartikeln (2–4 mg/L). Diese Ergebnisse sind in Abbildung 2 dargestellt. Schwarze Knötchen stellen hypericinreiche Drüsen dar, die natürlich vorkommen und einen Nutzen haben. In dieser Studie traten schwarze Knötchen hauptsächlich in Verbindung mit einer Bräunung des Gewebes auf, was auf ein günstiges Milieu für die Hypericin-Akkumulation hindeutet. Die Behandlung mit 2,4-D, Kinetin und Fe₃O₄-Nanopartikeln förderte das Kalluswachstum, reduzierte die Bräunung und erhöhte den Chlorophyllgehalt, was auf eine verbesserte Stoffwechselfunktion und eine potenzielle Reduktion oxidativer Schäden schließen lässt [37]. In dieser Studie wurden die Effekte von Kinetin in Kombination mit 2,4-D und Fe₃O₄-Nanopartikeln auf das Wachstum und die Entwicklung von Johanniskraut-Kallus untersucht (Abb. 3a–g). Frühere Studien haben gezeigt, dass Fe₃O₄-Nanopartikel antifungale und antimikrobielle Eigenschaften besitzen [38, 39] und in Kombination mit Pflanzenwachstumsregulatoren pflanzliche Abwehrmechanismen stimulieren und zelluläre Stressindikatoren reduzieren können [18]. Obwohl die Biosynthese sekundärer Pflanzenstoffe genetisch reguliert ist, hängt ihre tatsächliche Ausbeute stark von den Umweltbedingungen ab. Metabolische und morphologische Veränderungen können den Gehalt an Sekundärmetaboliten beeinflussen, indem sie die Expression spezifischer Pflanzengene regulieren und auf Umweltfaktoren reagieren. Darüber hinaus können Induktoren die Aktivierung neuer Gene auslösen, welche wiederum die Enzymaktivität stimulieren und letztendlich mehrere Biosynthesewege aktivieren, was zur Bildung von Sekundärmetaboliten führt. Eine weitere Studie zeigte, dass die Reduzierung der Beschattung die Sonneneinstrahlung erhöht und dadurch die Tagestemperaturen im natürlichen Lebensraum von *Hypericum perforatum* ansteigen lässt, was ebenfalls zu einer erhöhten Hypericin-Ausbeute beiträgt. Basierend auf diesen Daten untersuchte die vorliegende Studie die Rolle von Eisen-Nanopartikeln als potenzielle Induktoren in der Gewebekultur. Die Ergebnisse zeigten, dass diese Nanopartikel Gene, die an der Hesperidin-Biosynthese beteiligt sind, durch enzymatische Stimulation aktivieren und so zu einer erhöhten Akkumulation dieser Verbindung führen können (Abb. 2). Im Vergleich zu Pflanzen, die unter natürlichen Bedingungen wachsen, lässt sich daher argumentieren, dass die Produktion solcher Verbindungen in vivo ebenfalls gesteigert werden kann, wenn moderater Stress mit der Aktivierung von Genen kombiniert wird, die an der Biosynthese von Sekundärmetaboliten beteiligt sind. Kombinationsbehandlungen wirken sich im Allgemeinen positiv auf die Regenerationsrate aus, in einigen Fällen ist dieser Effekt jedoch abgeschwächt. Insbesondere die Behandlung mit 1 mg/L 2,4-D, 1,5 mg/L Kinase und verschiedenen Konzentrationen konnte die Regenerationsrate im Vergleich zur Kontrollgruppe unabhängig voneinander signifikant um 50,85 % steigern (Abb. 4c). Diese Ergebnisse legen nahe, dass spezifische Kombinationen von Nanohormonen synergistisch wirken und das Pflanzenwachstum sowie die Metabolitproduktion fördern können, was für die Gewebekultur von Heilpflanzen von großer Bedeutung ist. Palmer und Keller [50] zeigten, dass die Behandlung mit 2,4-D unabhängig die Kallusbildung in St. perforatum induzieren kann, während die Zugabe von Kinase die Kallusbildung und Regeneration signifikant verstärkt. Dieser Effekt beruhte auf der Verbesserung des Hormonhaushalts und der Stimulierung der Zellteilung. Bal et al. [51] fanden heraus, dass die Behandlung mit Fe₃O₄-NP unabhängig die Funktion antioxidativer Enzyme steigern und dadurch das Wurzelwachstum in St. perforatum fördern kann. Kulturmedien mit Fe₃O₄-Nanopartikeln in Konzentrationen von 0,5 mg/L, 1 mg/L und 1,5 mg/L verbesserten die Regenerationsrate von Flachspflanzen [52]. Die Verwendung von Kinetin, 2,4-Dichlorbenzothiazolinon und Fe₃O₄-Nanopartikeln verbesserte die Kallus- und Wurzelbildungsraten signifikant. Allerdings müssen die potenziellen Nebenwirkungen der Anwendung dieser Hormone bei der In-vitro-Regeneration berücksichtigt werden. Beispielsweise kann die langfristige oder hochkonzentrierte Anwendung von 2,4-Dichlorbenzothiazolinon oder Kinetin zu somatischer Klonvariation, oxidativem Stress, abnormaler Kallusmorphologie oder Vitrifikation führen. Daher ist eine hohe Regenerationsrate kein Indikator für genetische Stabilität. Alle regenerierten Pflanzen sollten mittels molekularer Marker (z. B. RAPD, ISSR, AFLP) oder zytogenetischer Analysen auf ihre Homogenität und Ähnlichkeit mit In-vivo-Pflanzen untersucht werden [53, 54, 55].
Diese Studie zeigte erstmals, dass die kombinierte Anwendung von Pflanzenwachstumsregulatoren (2,4-D und Kinetin) mit Fe₃O₄-Nanopartikeln die Morphogenese und die Akkumulation wichtiger bioaktiver Metaboliten (darunter Hypericin und Hyperosid) in *Hypericum perforatum* steigern kann. Das optimierte Behandlungsschema (1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L Kinetin + 4 mg/L Fe₃O₄-NPs) maximierte nicht nur die Kallusbildung, die Organogenese und die Ausbeute an Sekundärmetaboliten, sondern zeigte auch eine milde induzierende Wirkung, die potenziell die Stresstoleranz und den medizinischen Wert der Pflanze verbessert. Die Kombination von Nanotechnologie und Pflanzenzellkultur bietet eine nachhaltige und effiziente Plattform für die großtechnische In-vitro-Produktion von Arzneistoffen. Diese Ergebnisse ebnen den Weg für industrielle Anwendungen und zukünftige Forschung zu molekularen Mechanismen, Dosierungsoptimierung und genetischer Präzision und verknüpfen so die Grundlagenforschung an Heilpflanzen mit der praktischen Biotechnologie.
Veröffentlichungsdatum: 12. Dezember 2025