Das Wurmmittel N,N-Diethyl-m-toluamid (DEETEs wurde berichtet, dass DEET die Acetylcholinesterase (AChE) hemmt und aufgrund übermäßiger Vaskularisierung potenziell karzinogene Eigenschaften besitzt. In dieser Arbeit zeigen wir, dass DEET spezifisch Endothelzellen stimuliert, die die Angiogenese fördern und dadurch das Tumorwachstum steigern. DEET aktiviert zelluläre Prozesse, die zur Angiogenese führen, darunter Proliferation, Migration und Adhäsion. Dies ist mit einer erhöhten NO-Produktion und VEGF-Expression in Endothelzellen assoziiert. Die Hemmung von M3 oder die Verwendung pharmakologischer M3-Inhibitoren hob all diese Effekte auf, was darauf hindeutet, dass die DEET-induzierte Angiogenese M3-sensitiv ist. Experimente mit Kalziumsignalisierung in Endothel- und HEK-Zellen, die M3-Rezeptoren überexprimieren, sowie Bindungs- und Docking-Studien zeigen, dass DEET als allosterischer Modulator von M3-Rezeptoren wirkt. Darüber hinaus hemmt DEET die AChE, wodurch die Bioverfügbarkeit von Acetylcholin und dessen Bindung an M3-Rezeptoren erhöht und proangiogene Effekte durch allosterische Regulation verstärkt werden.
Primäre Endothelzellen (ECs) wurden aus der Aorta von Schweizer Mäusen isoliert. Die Extraktionsmethode wurde nach dem Kobayashi-Protokoll26 adaptiert. Murine ECs wurden bis zur vierten Passage in EBM-2-Medium mit 5 % hitzeinaktiviertem FBS kultiviert.
Der Einfluss zweier DEET-Konzentrationen auf die Proliferation von HUVEC, U87MG und BF16F10 wurde mithilfe des CyQUANT Zellproliferations-Assay-Kits (Molecular Probes, C7026) analysiert. Dazu wurden 5 × 10³ Zellen pro Well in einer 96-Well-Platte ausgesät, über Nacht anhaften gelassen und anschließend 24 h mit DEET behandelt. Nach Entfernen des Wachstumsmediums wurde Farbstoffbindungslösung zu jedem Well der Mikrotiterplatte gegeben und die Zellen 30 min bei 37 °C inkubiert. Die Fluoreszenzintensität wurde mit einem Mithras LB940 Multimode-Mikrotiterplatten-Reader (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Deutschland) mit 485-nm-Anregungsfiltern und 530-nm-Emissionsfiltern gemessen.
HUVEC wurden in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 10⁴ Zellen pro Well ausgesät. Die Zellen wurden 24 h lang mit DEET behandelt. Die Zellviabilität wurde mittels eines kolorimetrischen MTT-Assays (Sigma-Aldrich, M5655) bestimmt. Die optische Dichte wurde mit einem Multimode-Mikrotiterplatten-Reader (Mithras LB940) bei einer Wellenlänge von 570 nm gemessen.
Die Wirkung von DEET wurde mittels In-vitro-Angiogenese-Assays untersucht. Die Behandlung mit 10⁻⁸ M oder 10⁻⁵ M DEET erhöhte die Kapillarlänge in HUVECs (Abb. 1a, b, weiße Balken). Im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigte sich, dass die Kapillarlänge bei einer DEET-Konzentration von 10⁻¹⁴ bis 10⁻⁵ M ein Plateau erreichte (Abb. S2 im Anhang). Es wurde kein signifikanter Unterschied in der proangiogenen Wirkung von mit DEET im Konzentrationsbereich von 10⁻⁸ M und 10⁻⁵ M behandelten HUVECs in vitro festgestellt.
Um den Einfluss von DEET auf die Neovaskularisation zu bestimmen, führten wir In-vivo-Neovaskularisationsstudien durch. Nach 14 Tagen zeigten Mäuse, denen Endothelzellen injiziert wurden, die zuvor mit 10⁻⁸ M oder 10⁻⁵ M DEET vorkultiviert worden waren, einen signifikanten Anstieg des Hämoglobingehalts (Abb. 1c, weiße Balken).
Des Weiteren wurde die DEET-induzierte Neovaskularisation in U87MG-Xenotransplantat-tragenden Mäusen untersucht, denen täglich (i.p.) DEET in einer Dosis injiziert wurde, die bekanntermaßen Plasmakonzentrationen von 10⁻⁵ M induziert, was beim Menschen normal ist.²³ Detektierbare Tumoren (d. h. Tumoren >100 mm³) wurden 14 Tage nach der Injektion von U87MG-Zellen in die Mäuse beobachtet. Am 28. Tag war das Tumorwachstum in den mit DEET behandelten Mäusen im Vergleich zu den Kontrollmäusen signifikant erhöht (Abb. 1d, Quadrate). Die CD31-Färbung der Tumoren zeigte zudem, dass DEET die Kapillarfläche signifikant erhöhte, nicht aber die Mikrovaskuläre Dichte (Abb. 1e–g).
Um die Rolle muskarinischer Rezeptoren bei der DETA-induzierten Proliferation zu bestimmen, wurden 10⁻⁸ M oder 10⁻⁵ M DETA in Gegenwart von pFHHSiD (10⁻⁷ M, einem selektiven M3-Rezeptorantagonisten) verwendet. Die Behandlung von HUVEC erfolgte mit pFHHSiD, das die proliferativen Eigenschaften von DETA in allen Konzentrationen vollständig blockierte (Tabelle 1).
Unter diesen Bedingungen untersuchten wir auch, ob DEET die Kapillarlänge in HUVEC-Zellen erhöht. Ebenso verhinderte pFHHSiD die DEET-induzierte Kapillarverlängerung signifikant (Abb. 1a, b, graue Balken). Darüber hinaus führten wir ähnliche Experimente mit M3-siRNA durch. Obwohl die Kontroll-siRNA die Kapillarbildung nicht förderte, hob die Hemmung des muskarinischen M3-Rezeptors die Fähigkeit von DEET auf, die Kapillarlänge zu erhöhen (Abb. 1a, b, schwarze Balken).
Des Weiteren wurden sowohl die durch 10⁻⁸ M oder 10⁻⁵ M DEET induzierte Vaskularisierung in vitro als auch die Neovaskularisierung in vivo durch pFHHSiD vollständig blockiert (Abb. 1c, d, Kreise). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass DEET die Angiogenese über einen Signalweg fördert, der empfindlich auf selektive M3-Rezeptorantagonisten oder M3-siRNA reagiert.
AChE ist das molekulare Zielmolekül von DEET. Wirkstoffe wie Donepezil, die als AChE-Inhibitoren wirken, können die Angiogenese von Endothelzellen in vitro und in Mausmodellen der Hinterbeinischämie stimulieren14. Wir untersuchten die Wirkung zweier DEET-Konzentrationen auf die AChE-Enzymaktivität in HUVEC. Niedrige (10-8 M) und hohe (10-5 M) DEET-Konzentrationen reduzierten die endotheliale AChE-Aktivität im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abb. 2).
Beide DEET-Konzentrationen (10⁻⁸ M und 10⁻⁵ M) reduzierten die Acetylcholinesterase-Aktivität in HUVEC. BW284c51 (10⁻⁵ M) diente als Kontrolle für Acetylcholinesterase-Inhibitoren. Die Ergebnisse sind als prozentuale AChE-Aktivität in mit den beiden DEET-Konzentrationen behandelten HUVEC im Vergleich zu den mit Vehikel behandelten Zellen dargestellt. Die Werte sind als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) aus sechs unabhängigen Experimenten angegeben. *p < 0,05 im Vergleich zur Kontrolle (Kruskal-Wallis- und Dunn-Test für Mehrfachvergleiche).
Stickstoffmonoxid (NO) ist am angiogenen Prozess beteiligt33. Daher wurde die NO-Produktion in DEET-stimulierten HUVECs untersucht. Die NO-Produktion in DEET-behandelten Endothelzellen war im Vergleich zu Kontrollzellen erhöht, erreichte jedoch erst bei einer Dosis von 10-8 M Signifikanz (Abb. 3c). Um die molekularen Veränderungen zu bestimmen, die die DEET-induzierte NO-Produktion steuern, wurden die eNOS-Expression und -Aktivierung mittels Western Blot analysiert. Obwohl die DEET-Behandlung die eNOS-Expression nicht veränderte, erhöhte sie die eNOS-Phosphorylierung an der aktivierenden Stelle (Ser-1177) signifikant, während die Phosphorylierung an der inhibierenden Stelle (Thr-495) im Vergleich zu unbehandelten Zellen abnahm (Abb. 3d). Darüber hinaus wurde das Verhältnis von phosphoryliertem eNOS an der aktivierenden zur inhibierenden Stelle berechnet, nachdem die Menge an phosphoryliertem eNOS auf die Gesamtmenge des Enzyms normiert wurde. Dieses Verhältnis war in mit jeder DEET-Konzentration behandelten HUVECs im Vergleich zu unbehandelten Zellen signifikant erhöht (Abb. 3d).
Schließlich wurde die Expression von VEGF, einem der wichtigsten proangiogenen Faktoren, mittels Western Blot analysiert. DEET erhöhte die VEGF-Expression signifikant, während pFHHSiD diese Expression vollständig blockierte.
Da die Wirkungen von DEET sowohl durch pharmakologische Blockade als auch durch Herunterregulierung von M3-Rezeptoren beeinflusst werden, untersuchten wir die Hypothese, dass DEET die Kalziumsignalübertragung verstärken könnte. Überraschenderweise konnte DEET in beiden verwendeten Konzentrationen weder in HUVEC (Daten nicht gezeigt) noch in HEK/M3 (Abb. 4a, b) den zytoplasmatischen Kalziumspiegel erhöhen.
Veröffentlichungsdatum: 30. Dezember 2024