Das Anthelminthikum N,N-Diethyl-m-toluamid (DEET) hemmt Berichten zufolge AChE (Acetylcholinesterase) und besitzt aufgrund übermäßiger Vaskularisierung potenzielle krebserregende Eigenschaften. In dieser Arbeit zeigen wir, dass DEET spezifisch Endothelzellen stimuliert, die die Angiogenese fördern und dadurch das Tumorwachstum steigern. DEET aktiviert zelluläre Prozesse, die zur Angiogenese führen, darunter Proliferation, Migration und Adhäsion. Dies ist mit einer erhöhten NO-Produktion und VEGF-Expression in Endothelzellen verbunden. Die Stilllegung von M3 oder die Verwendung pharmakologischer M3-Inhibitoren hoben all diese Effekte auf, was darauf hindeutet, dass die DEET-induzierte Angiogenese M3-sensitiv ist. Experimente mit Calciumsignalen in Endothel- und HEK-Zellen, die M3-Rezeptoren überexprimieren, sowie Bindungs- und Dockingstudien weisen darauf hin, dass DEET als allosterischer Modulator von M3-Rezeptoren fungiert. Darüber hinaus hemmt DEET AChE, erhöht dadurch die Bioverfügbarkeit von Acetylcholin und dessen Bindung an M3-Rezeptoren und verstärkt die proangiogene Wirkung durch allosterische Regulation.
Primäre ECs wurden aus der Aorta von Swiss-Mäusen isoliert. Die Extraktionsmethode wurde an das Kobayashi-Protokoll 26 angepasst. Murine ECs wurden bis zur vierten Passage in EBM-2-Medium, ergänzt mit 5 % hitzeinaktiviertem FBS, kultiviert.
Der Effekt zweier DEET-Konzentrationen auf die Proliferation von HUVEC, U87MG oder BF16F10 wurde mit dem CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026) untersucht. Kurz gesagt wurden 5.103 Zellen pro Well in eine 96-Well-Platte ausgesät, über Nacht anhaften gelassen und anschließend 24 Stunden mit DEET behandelt. Nach Entfernen des Nährmediums wurde in jedes Well der Mikroplatte eine Farbstoffbindungslösung gegeben und die Zellen 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. Die Fluoreszenzwerte wurden mit einem Mithras LB940 Multimode-Mikroplatten-Reader (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Deutschland) bestimmt, der mit 485-nm-Anregungsfiltern und 530-nm-Emissionsfiltern ausgestattet war.
HUVEC wurden in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 104 Zellen pro Well ausgesät. Die Zellen wurden 24 Stunden lang mit DEET behandelt. Die Zellviabilität wurde mittels kolorimetrischem MTT-Test (Sigma-Aldrich, M5655) bestimmt. Die optischen Dichtewerte wurden auf einem Multimode-Mikroplatten-Reader (Mithras LB940) bei einer Wellenlänge von 570 nm ermittelt.
Die Wirkung von DEET wurde mithilfe von In-vitro-Angiogenese-Assays untersucht. Die Behandlung mit 10-8 M oder 10-5 M DEET erhöhte die Kapillarlängenbildung in HUVECs (Abb. 1a, b, weiße Balken). Im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigte die Behandlung mit DEET-Konzentrationen zwischen 10-14 und 10-5 M, dass die Kapillarlänge bei 10-8 M DEET ein Plateau erreichte (Ergänzende Abb. S2). Es wurde kein signifikanter Unterschied in der proangiogenen Wirkung von HUVECs in vitro festgestellt, die mit DEET im Konzentrationsbereich von 10-8 M und 10-5 M behandelt wurden.
Um den Einfluss von DEET auf die Neovaskularisierung zu untersuchen, führten wir In-vivo-Studien zur Neovaskularisierung durch. Nach 14 Tagen zeigten Mäuse, denen zuvor mit 10-8 M oder 10-5 M DEET vorkultivierte Endothelzellen injiziert worden waren, einen signifikanten Anstieg des Hämoglobingehalts (Abb. 1c, weiße Balken).
Darüber hinaus wurde die DEET-induzierte Neovaskularisierung an U87MG-Xenograft-tragenden Mäusen untersucht, denen täglich (ip) DEET in einer Dosis injiziert wurde, die bekanntermaßen Plasmakonzentrationen von 10-5 M induziert, was bei exponierten Menschen normal ist. in 23. 14 Tage nach der Injektion von U87MG-Zellen in Mäuse wurden nachweisbare Tumoren (d. h. Tumoren >100 mm3) beobachtet. Am 28. Tag war das Tumorwachstum bei DEET-behandelten Mäusen im Vergleich zu Kontrollmäusen signifikant erhöht (Abb. 1d, Quadrate). Darüber hinaus zeigte die CD31-Färbung der Tumoren, dass DEET die Kapillarfläche signifikant erhöhte, nicht jedoch die Mikrogefäßdichte (Abb. 1e–g).
Um die Rolle muskarinischer Rezeptoren bei der DETA-induzierten Proliferation zu untersuchen, wurden 10-8 M oder 10-5 M DETA in Gegenwart von pFHHSiD (10-7 M, ein selektiver M3-Rezeptorantagonist) verwendet. Die Behandlung von HUVEC mit pFHHSiD blockierte die proliferativen Eigenschaften von DETA in allen Konzentrationen vollständig (Tabelle 1).
Unter diesen Bedingungen untersuchten wir auch, ob DEET die Kapillarlänge in HUVEC-Zellen erhöht. Ebenso verhinderte pFHHSiD die durch DEET induzierte Kapillarlänge signifikant (Abb. 1a, b, graue Balken). Darüber hinaus wurden ähnliche Experimente mit M3-siRNA durchgeführt. Obwohl die Kontroll-siRNA die Kapillarbildung nicht effektiv förderte, verhinderte die Inaktivierung des M3-Muskarinrezeptors die Fähigkeit von DEET, die Kapillarlänge zu erhöhen (Abb. 1a, b, schwarze Balken).
Darüber hinaus wurden sowohl die durch 10-8 M oder 10-5 M DEET induzierte Vaskularisierung in vitro als auch die Neovaskularisierung in vivo durch pFHHSiD vollständig blockiert (Abb. 1c, d, Kreise). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass DEET die Angiogenese über einen Weg fördert, der empfindlich auf selektive M3-Rezeptorantagonisten oder M3-siRNA reagiert.
AChE ist das molekulare Ziel von DEET. Medikamente wie Donepezil, die als AChE-Hemmer wirken, können die endotheliale Angiogenese in vitro und in Maus-Hintergliedmaßen-Ischämiemodellen stimulieren14. Wir testeten den Effekt zweier DEET-Konzentrationen auf die AChE-Enzymaktivität in HUVEC. Niedrige (10-8 M) und hohe (10-5 M) DEET-Konzentrationen verringerten die endotheliale AChE-Aktivität im Vergleich zu Kontrollbedingungen (Abb. 2).
Beide DEET-Konzentrationen (10-8 M und 10-5 M) reduzierten die Acetylcholinesterase-Aktivität auf HUVEC. BW284c51 (10-5 M) wurde als Kontrolle für Acetylcholinesterase-Hemmer verwendet. Die Ergebnisse sind als Prozentsatz der AChE-Aktivität auf HUVEC, die mit den beiden DEET-Konzentrationen behandelt wurden, im Vergleich zu Vehikel-behandelten Zellen angegeben. Die Werte sind als Mittelwert ± Standardfehler (SEM) aus sechs unabhängigen Experimenten angegeben. *p < 0,05 im Vergleich zur Kontrolle (Kruskal-Wallis- und Dunn-Mehrfachvergleichstest).
Stickstoffmonoxid (NO) ist am angiogenen Prozess beteiligt 33, daher wurde die NO-Produktion in DEET-stimulierten HUVECs untersucht. Die mit DEET behandelte endotheliale NO-Produktion war im Vergleich zu Kontrollzellen erhöht, erreichte aber nur bei einer Dosis von 10-8 M Signifikanz (Abb. 3c). Um die molekularen Veränderungen zu bestimmen, die die DEET-induzierte NO-Produktion steuern, wurden eNOS-Expression und -Aktivierung per Western Blot analysiert. Obwohl die DEET-Behandlung die eNOS-Expression nicht veränderte, erhöhte sie die eNOS-Phosphorylierung an ihrer aktivierenden Stelle (Ser-1177) signifikant und verringerte gleichzeitig ihre hemmende Stelle (Thr-495) im Vergleich zu unbehandelten Zellen bei der eNOS-Phosphorylierung (Abb. 3d). Außerdem wurde das Verhältnis von phosphoryliertem eNOS an der Aktivierungsstelle und der hemmenden Stelle berechnet, nachdem die Menge an phosphoryliertem eNOS auf die Gesamtmenge des Enzyms normalisiert wurde. Dieses Verhältnis war bei HUVECs, die mit jeder DEET-Konzentration behandelt wurden, im Vergleich zu unbehandelten Zellen signifikant erhöht (Abb. 3d).
Abschließend wurde die Expression von VEGF, einem der wichtigsten proangiogenen Faktoren, mittels Western Blot analysiert. DEET erhöhte die VEGF-Expression signifikant, während pFHHSiD diese Expression vollständig blockierte.
Da die Wirkung von DEET sowohl auf eine pharmakologische Blockade als auch auf eine Herunterregulierung der M3-Rezeptoren reagiert, prüften wir die Hypothese, dass DEET die Kalziumsignalisierung verstärken könnte. Überraschenderweise führte DEET bei beiden verwendeten Konzentrationen nicht zu einer Erhöhung des zytoplasmatischen Kalziums in HUVEC (Daten nicht gezeigt) und HEK/M3 (Abb. 4a, b).
Veröffentlichungszeit: 30. Dezember 2024