Pestizide spielen eine entscheidende Rolle bei der Bekämpfung globaler Nahrungsmittelknappheit und vektorübertragener Krankheiten. Die zunehmende Pestizidresistenz erfordert jedoch dringend die Entwicklung neuer Wirkstoffe, die auf bisher wenig genutzte Zielstrukturen abzielen. Transiente Rezeptorpotentialkanäle (TRPV-Kanäle) von Insekten – Nanzhong (Nan) und inaktive Kanäle (Iav) – können heterologe Kanäle (Nan-Iav) bilden und in mechanosensorischen Organen lokalisiert sein, die Geotropismus, Hörvermögen und Propriozeption bei Insekten vermitteln. Einige Pestizide, wie beispielsweise Aphidopyrrolidon (AP), wirken über unbekannte Mechanismen auf Nan-Iav. AP ist wirksam gegen stechend-saugende Insekten (Hemiptera), indem es die Nahrungsaufnahme durch Störung der Filamentfunktion unterbindet. AP bindet ausschließlich an Nan, aber nur Nan-Iav kann mit Agonisten, einschließlich endogenem Nicotinamid (NAM), interagieren und dadurch Kanalaktivität zeigen. Trotz des Potenzials von Nan-Iav als Zielstruktur für Insektizide ist wenig über dessen Kanalaufbau, regulatorische Bindungsstellen und Ca²⁺-abhängige Regulation bekannt, was die Weiterentwicklung von Insektiziden behindert. In dieser Studie wurde die Struktur von Nan-Iav in Hemiptera-Insekten im Calmodulin-freien Zustand sowie mit AP und NAM an der Grenze der Ankyrin-Repeat-Domäne (ARD) mittels Kryo-Elektronenmikroskopie untersucht. Überraschenderweise fanden wir heraus, dass das Nan-Protein selbst ein Pentamer bilden kann, das durch AP-vermittelte ARD-Interaktionen stabilisiert wird. Diese Studie deckt molekulare Interaktionen zwischen Insektiziden und Agonisten und Nan-Iav auf, unterstreicht die Bedeutung der ARD für die Kanalfunktion und den Kanalaufbau und erforscht den Mechanismus der Ca²⁺-Regulation.
Vor dem Hintergrund des zunehmend gravierenden globalen Klimawandels stellt die sich verschlechternde globale Ernährungssicherheit eine der größten Herausforderungen des 21. Jahrhunderts dar, mit weitreichenden Folgen für die Gesellschaft.1,2Der Bericht „State of Food Security and Nutrition in the World 2023“ (SOFI) der Weltgesundheitsorganisation schätzt, dass weltweit etwa 2,33 Milliarden Menschen unter mäßiger bis schwerer Ernährungsunsicherheit leiden – ein seit langem bestehendes Problem.3,4Leider gehen jährlich schätzungsweise 20 bis 30 Prozent oder mehr der Ernteerträge durch Schädlinge und Krankheitserreger verloren, und es wird erwartet, dass die globale Erwärmung die Schädlingsresistenz und die Anfälligkeit der Nutzpflanzen noch verschärfen wird.4, 5, 6, 7, 8Die Entwicklung von Pestiziden ist nicht nur entscheidend, um Nutzpflanzen vor Schädlingen zu schützen und die Ausbreitung von durch Vektoren übertragenen Krankheitserregern zu verringern, sondern auch, um durch Vektoren übertragene Krankheiten beim Menschen wie Denguefieber, Malaria und Chagas-Krankheit zu bekämpfen, die zunehmend resistent gegen Pestizide werden.5, 9, 10, 11
Unter den wichtigsten Zielstrukturen neurotoxischer Insektizide stellt der heterotetramere TRPV-Kanal Nanchung (Nan)-Inaktiv (Iav) eine Klasse von Insektizidzielen dar, die erst im letzten Jahrzehnt entdeckt wurden und zu denen auch kommerziell erhältliche Insektizide wie Imidacloprid und Pyraclostrobin gehören.12,13,14Das halbsynthetische Insektizid Aphidopyrrolifen (AP) ist ein neu entwickeltes und kommerzialisiertes Produkt, dessen Hauptbestandteil das aktive Insektizid Inscalis® ist, welches AP in einem subnanomolaren Aktivitätsniveau bindet.15AP weist eine geringe akute Toxizität gegenüber Bestäubern, Nützlingen und anderen Nichtzielorganismen auf und kann bei sachgemäßer Anwendung gemäß den Anweisungen auf dem Etikett den Resistenzdruck gegenüber anderen Insektiziden verringern.16, 17, 18Nan und Iav sind weit verbreitet in Insektenarten, werden nur in den Chordal-Dehnungsrezeptorneuronen der Antennen und Gliedmaßen gemeinsam exprimiert und sind entscheidend für das Hören, die Schwerkraftwahrnehmung und die Propriozeption.13, 16, 19, 20, 21, 22AP, Imidacloprid und Pyraclostrobin stimulieren den Nan-Iav-Komplex über einen einzigartigen Mechanismus und hemmen dadurch letztendlich die propriozeptive Signaltransduktion.13,16,23Bei stechend-saugenden Insekten (Hemiptera) wie Blattläusen und Weißen Fliegen beeinträchtigt der Verlust der Propriozeption ihre Nahrungsaufnahme und führt letztendlich zum Tod.13,24Interessanterweise weist AP eine hohe Affinität zum Nan-Iav-Komplex und eine geringe Affinität zu Nan allein auf. Die Bindung von AP an Nan-Iav induziert einen elektrischen Strom, die Bindung an Nan allein stimuliert jedoch nicht die Kanalaktivität. Iav selbst bindet überhaupt nicht an AP.16Dies deutet darauf hin, dass Nan und Iav unterschiedliche Nan-Iav-Kanal-Komplexe bilden können (z. B. mit unterschiedlichen stöchiometrischen Verhältnissen oder unterschiedlichen Anordnungen innerhalb desselben stöchiometrischen Verhältnisses) oder dass AP an mehrere Bindungsstellen binden kann. Darüber hinaus bindet der natürliche Agonist Nicotinamid (NAM) mit mikromolarer Affinität an Drosophila Nan-Iav und zeigt in vitro ähnliche Effekte wie Blattläuse (AP).16,25und die Vermehrung und Nahrungsaufnahme der Blattläuse hemmen, was letztendlich zu deren Tod führt.25,26Diese Daten werfen zahlreiche Fragen auf. Beispielsweise ist weiterhin unklar, wie der Nan-Iav-Heterodimer gebildet wird, welche Bindungsstellen zur Modulation kleiner Moleküle genutzt werden und wie diese kleinen Moleküle die Kanalfunktion durch Unterdrückung der Propriozeption regulieren. Des Weiteren sind die Gründe dafür, dass Nan selbst inaktiv ist und eine geringe Affinität zu Aktionspotenzialen aufweist, während der Nan-Iav-Heterodimer aktiv ist und Aktionspotenziale mit höherer Affinität bindet, ungeklärt. Schließlich ist wenig über die Ca²⁺-abhängige Regulation der Nan-Iav-Funktion und deren Integration in neuronale Signalprozesse bekannt.13,21
In dieser Studie klärten wir mithilfe von Kryo-Elektronenmikroskopie, Elektrophysiologie und Radioligandenbindungstechniken die Assemblierung von Nan-Iav und den Mechanismus seiner Bindung an niedermolekulare Regulatoren auf. Darüber hinaus wiesen wir konstitutiv gebundenes Calmodulin (CaM) an Iav und AP-stabilisierte Nan-Pentamere nach. Diese Ergebnisse liefern wichtige Erkenntnisse zur Regulation von Calciumionen in Kanälen, zur Kanalassemblierung und zu den Faktoren, die die Ligandenbindungsaffinität bestimmen. Besonders wichtig ist, dass wir die zentrale Rolle von ARD in diesen Prozessen bestätigen konnten. Unsere Untersuchung vollständiger Insektenkanäle, die an relevante landwirtschaftliche Pestizide gebunden sind, …27, 28, 29Dies eröffnet Perspektiven für die Entwicklung der Pestizidindustrie, verbessert die Wirksamkeit und Spezifität von Pestiziden und ermöglicht die Anwendung von TRPV-gerichteten Verbindungen auf andere Arten, um die globale Ernährungssicherheit und die Ausbreitung von durch Vektoren übertragenen Krankheiten zu bekämpfen.
Wir fanden außerdem heraus, dass Nan-Iav durch Ca2+ reguliert wird und dass dieser Regulationsmechanismus durch konstitutiv gebundenes CaM vermittelt wird. Wichtig ist, dass sich diese Ca2+-abhängige Regulation von Nav durch CaM deutlich von den Regulationsmechanismen anderer Ionenkanäle (z. B. spannungsgesteuerte Na+-Kanäle und TRPV5/6-Kanäle) unterscheidet.52, 53, 54, 55, 56, 57Im Nav1.2-Kanal assoziiert die C-terminale Domäne von CaM helikal mit der C-terminalen Domäne (CTD), und Ca2+ induziert die Bindung seiner N-terminalen Domäne an den distalen Abschnitt der CTD.56Im TRPV5/6-Kanal bindet die C-terminale Domäne von CaM an CTH, und Ca2+ induziert eine Aufwärtsstreckung seiner N-terminalen Domäne in die Pore hinein, wodurch die Kationenpermeabilität blockiert wird.53,54Wir schlagen ein Modell für die Ca²⁺-regulierte Funktion des Nan-Iav-CaM-Komplexes vor (Abb. 4h). In diesem Modell bindet die N-terminale Domäne von CaM konstitutiv an die C-terminale Domäne (CTH) von Iav. Im Ruhezustand (niedrige Ca²⁺-Konzentration) interagiert die C-terminale Domäne von CaM mit Nan, stabilisiert die ARD-Konformation und fördert dadurch die Kanalöffnung. Die Bindung eines Agonisten/Insektizids an den Kanal induziert die Porenöffnung und führt zu einem Ca²⁺-Einstrom. Ca²⁺ bindet anschließend an CaM und bewirkt die Dissoziation der C-terminalen Domäne von der ARD von Nan. Da die Blockierung der CaM-Bindung die hemmende Wirkung von Ca²⁺ praktisch aufhebt, moduliert diese Dissoziation die ARD-Mobilität und führt so zu einer Ca²⁺-abhängigen Hemmung oder Desensibilisierung. Die rasche Wiederherstellung der Kanalströme nach Calciumionen-Elution (Abb. 4g) deutet darauf hin, dass dieser Mechanismus schnelle Reaktionen auf Ca²⁺-vermittelte neuronale Signale ermöglicht. Darüber hinaus wurde berichtet, dass die C-terminale Region von Iav, die noch weitgehend unerforscht ist, weitere Funktionen bei der Kanallokalisierung und Stromregulation ausübt.²¹
Unsere Studie präsentiert die hochauflösende Struktur eines Insektizid-Insektizid-TRP-Kanal-Komplexes von landwirtschaftlicher Bedeutung – eine uns bisher unbekannte Entdeckung. Bemerkenswert ist, dass wir die Struktur und Funktion des Insektenkanals in menschlichen Zellen (HEK293S GnTi–) und nicht in Insektenzellen charakterisiert haben. Angesichts zunehmender Insektizidresistenz und des anhaltenden Drucks auf die Ernährungssicherheit und Krankheitserreger liefert unsere Arbeit wichtige Informationen, die die Entwicklung neuer Insektizide zum Wohle der menschlichen Gesundheit und der globalen Ernährungssicherheit erleichtern werden. Studien haben gezeigt, dass Insektizide wie AP bei sachgemäßer Anwendung gegen einige Schädlinge wirksam sind und eine geringe akute Toxizität gegenüber nützlichen Bestäubern aufweisen, was ihre Umweltverträglichkeit belegt.13,16Des Weiteren hat die Prüfung einiger AP-Derivate an Mücken gezeigt, dass diese schließlich ihre Flugfähigkeit verlieren. Das Verständnis der Bindung dieser modulierenden Verbindungen an Nan-Iav wird die Modifizierung bestehender Verbindungen oder die Entwicklung neuer Verbindungen für eine effektivere Behandlung erleichtern.präziseSchädlingsbekämpfung. Unsere Studie zeigt, dass die Nan-Iav-ARD-Schnittstelle nicht nur für die Regulation der Aktivität endogener Verbindungen, Pestizide und Ca²⁺-CaM, sondern auch für den Kanalaufbau entscheidend ist. Wir vermuten, dass die Störung der Heterodimerbildung durch niedermolekulare Substanzen ein vielversprechender Ansatz zur Entwicklung von Ionenkanalinhibitoren sein könnte.
Von den acht orthologen Genen wurden die vollständigen Gene des Braunen Käfers (Halyomorpha halys) Nanchung und Inactive ausgewählt, da sie eine ausgezeichnete Stabilität gegenüber Detergenzien aufwiesen. Die synthetisierten Gene wurden für die Expression im Menschen kodonoptimiert und mithilfe der Restriktionsenzyme XhoI und EcoRI in den pBacMam pCMV-DEST-Vektor (Life Technologies) kloniert. Dadurch wurde sichergestellt, dass die Klone im Leserahmen mit den C-terminalen GFP-FLAG-10xHis- und mCherry-FLAG-10xHis-Tags lagen, welche durch die HRC-3C-Protease (PPX) abgespalten werden und somit eine unabhängige Expression ermöglichen.AusdruckDie zum Klonieren von Nanchung und Inactive in den pBacMam-Vektor verwendeten Primer waren folgende:
Mikroskopische Aufnahmen einzelner Partikel wurden mit einem Titan Krios G2 Transmissionselektronenmikroskop (FEI) mit K3-Kamera und Gatan BioQuantum Energiefilter angefertigt. Das Mikroskop wurde bei 300 keV mit einer Energieeinstellung von 20 eV, einer Pixelgröße von 1,08 Å/Pixel (nominale Vergrößerung 81.000x) und einem Defokusgradienten von -0,8 bis -2,2 μm betrieben. Die Videoaufzeichnung erfolgte mit 40 Bildern pro Sekunde mit einem Latitude S Mikroskop (Gatan) bei einer nominellen Dosisleistung von 25 e–px−1 s−1, einer Belichtungszeit von 2,4 s und einer Gesamtdosis von ca. 60 e–Å−2.
Die Korrektur strahlungsinduzierter Bewegungen und die Dosisgewichtung wurden mit MotionCor2 in RELION 4.061 auf dem Film durchgeführt. Die Schätzung der Kontrasttransferfunktionsparameter (CTF) erfolgte in cryoSPARC mittels der patchbasierten CTF-Schätzmethode62. Mikrofotografien mit einer CTF-Anpassungsauflösung ≥ 4 Å wurden von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Typischerweise wurde eine Teilmenge von 500–1000 Mikrofotografien für die Punktselektion in cryoSPARC verwendet. Anschließend wurden nach der Filterung mehrere Runden 2D-Klassifizierung durchgeführt, um ein klares Referenzbild für die templatebasierte Partikelselektion zu erhalten. Die Partikel wurden dann mithilfe von 64-Pixel-Begrenzungsrahmen und 4-facher Binning-Methode extrahiert. Mehrere Runden 2D-Klassifizierung wurden durchgeführt, um unerwünschte Partikelkategorien zu entfernen. Das initiale 3D-Modell wurde mittels Ab-initio-Rekonstruktion rekonstruiert und mit nichtuniformer Verfeinerung in cryoSPARC verfeinert. Die 3D-Klassifizierung erfolgte in cryoSPARC oder RELION basierend auf der ARD-Heterogenität. Es wurde keine signifikante Heterogenität der Membrandomänen beobachtet. Die Partikel wurden mit den C1- und C2-Methoden verfeinert; Partikel mit höherer C2-Auflösung wurden als symmetrisch bezüglich C2 betrachtet und zur Bayes’schen Verfeinerung in RELION importiert. Anschließend wurden die Partikel zur finalen nicht-uniformen und lokalen Verfeinerung zurück in cryoSPARC übertragen. Die finale Auflösung und die Partikelanzahl sind in Tabelle 1 dargestellt.
Bei der Bearbeitung von Nan+AP-Pentameren untersuchten wir verschiedene Methoden zur Verbesserung der Auflösung von Membrandomänen (insbesondere der Porenregion), wie z. B. Signalsubtraktion und TMD-Maskierung. Diese Versuche blieben jedoch aufgrund der potenziell extremen Unordnung in der Porenregion und der allgemeinen Heterogenität der TMD erfolglos. Die endgültige Auflösung wurde mithilfe einer Maske berechnet, die automatisch durch die nicht-uniforme Verarbeitungsmethode in cryoSPARC generiert wurde und primär auf die ARD-Region abzielte. Dadurch wurde eine deutlich höhere Auflösung als die der Membrandomänen (insbesondere der VSLD-Region) erzielt.
Zunächst wurden mit Coot63 initiale De-novo-Modelle der Apo-Formen der Nanchung- und Inaktiv-Bugs generiert. Modelle der Nan- und Iav-Bugs wurden mit AlphaFold264 erstellt, um Bereiche mit geringer Konfidenz zu identifizieren. Die Calmodulin-Modellierung basierte auf Rigid-Body-Fits der Ca²⁺-bindenden und Ca²⁺-freien Modelle aus den PDB-Zugangsnummern 4JPZ56 bzw. 1CFD65. Die Modelle wurden mittels sphärischer Verfeinerung optimiert, um die korrekte Stereochemie und eine gute Geometrie zu gewährleisten. Phosphatidylcholin, Phosphatidylethanolamin und Phosphatidylserin wurden anschließend als wohldefinierte Lipiddichten modelliert, und die NAM- und AP-Liganden wurden in den entsprechenden Dichten der Tight Junctions platziert. Constraint-Dateien wurden aus der SMILES-Zeichenkette der Isoformen mit eLBOW in PHENIX66 generiert. Abschließend wurden die Modelle in PHENIX im Realraum mittels lokaler Gittersuche und globaler Minimierung unter Berücksichtigung von Sekundärstrukturbeschränkungen verfeinert. Der MolProbity-Server wurde zur Modellverfeinerung und Strukturanalyse verwendet, die Illustrationen wurden mit PyMOL und UCSF Chimera X erstellt.67,68,69 Die Aperturanalyse erfolgte mit dem HOLE-Server70 und die Sequenzkonservierungskartierung mit dem Consurf-Server.71
Die statistische Analyse erfolgte mit Igor Pro 6.2, Excel Office 365 und GraphPad Prism 7.0. Alle quantitativen Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler (SEM) angegeben. Zum Vergleich zweier Gruppen wurde der zweiseitige, ungepaarte t-Test nach Student verwendet. Zum Vergleich mehrerer Gruppen wurde eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) mit anschließendem Dunnett-Post-hoc-Test durchgeführt. *p < 0,05< 0,05, **P< 0,01 und ***PWerte < 0,001 wurden je nach Datenverteilung als statistisch signifikant betrachtet. Kd- und Ki-Werte sowie deren asymmetrische 95%-Konfidenzintervalle wurden mit GraphPad Prism 10 berechnet.
Weitere Einzelheiten zur Studienmethodik finden Sie in der Zusammenfassung des Nature Portfolio Reports, die in diesem Artikel verlinkt ist.
Das Ausgangsmodell wurde anhand der Calmodulin-Modelle aus den PDB-Datenbanken 4JPZ und 1CFD erstellt. Die Koordinaten wurden in der Proteindatenbank (PDB) unter den Zugangsnummern 9NVN (Nan-Iav-CaM ohne Ligand), 9NVO (Nan-Iav-CaM gebunden an Nicotinamid), 9NVP (Nan-Iav-CaM gebunden an Nicotinamid und EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM gebunden an Aphenidolpyrrolin und Calcium), 9NVR (Nan-Iav-CaM gebunden an Aphenidolpyrrolin und EDTA) und 9NVS (Nan-Pentamer gebunden an Aphenidolpyrrolin) hinterlegt. Die entsprechenden Kryo-Elektronenmikroskopie-Aufnahmen sind in der Electron Microscopy Database (EMDB) unter den folgenden Zugangsnummern hinterlegt: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM ohne Ligand), EMD-49845 (Nan-Iav-CaM-Komplex mit Nicotinamid), EMD-49846 (Nan-Iav-CaM-Komplex mit Nicotinamid und EDTA), EMD-49847 (Nan-Iav-CaM-Komplex mit Aphidopyrrollin und Calcium), EMD-49848 (Nan-Iav-CaM-Komplex mit Aphidopyrrollin und EDTA) und EMD-49849 (Nan-Pentamer-Komplex mit Aphidopyrrollin). Die Rohdaten für die funktionelle Analyse werden in dieser Arbeit präsentiert.
Veröffentlichungsdatum: 28. Januar 2026